一種白血病單鏈抗體庫(kù)及其構(gòu)建方法和應(yīng)用技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)提供一種白血病噬菌體單鏈抗體庫(kù)，以噬菌粒pCANTAB-5E為載體，庫(kù)容達(dá)到1.5×109，經(jīng)DNA測(cè)序證明其多樣性良好。從該全人源白血病單鏈抗體庫(kù)中，通過(guò)噬菌體展示技術(shù)，以特定的白血病相關(guān)抗原為靶標(biāo)，經(jīng)過(guò)多輪淘篩，可以方便地獲得白血病細(xì)胞特異的全人源單鏈抗體。本發(fā)明專利技術(shù)提供的抗體庫(kù)的庫(kù)容量大，多樣性良好；包含全套人類單鏈抗體的組合；單鏈抗體由重鏈可變區(qū)VH和輕鏈可變區(qū)VL通過(guò)連接肽(GGGGS)3連接而成，且含有完整的抗原結(jié)合部位。所述方法可操作性強(qiáng)，庫(kù)容量大，可方便地篩選出對(duì)白血病特異的全人源單鏈抗體，這些全人源單鏈抗體可制備為靶向藥物，用于白血病的治療。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)屬基因工程，涉及一種全人源白血病單鏈抗體庫(kù)和其構(gòu)建方法，及其在制備白血病抗體藥物中的應(yīng)用。
技術(shù)介紹
自K6hler和Milstein創(chuàng)立淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)至今,單克隆抗體在腫瘤的診斷和治療領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。第一代應(yīng)用于人類疾病治療的主要是鼠源性單抗，但是鼠單抗的主要缺點(diǎn)是引起人體免疫反應(yīng)，人體產(chǎn)生的人抗鼠抗體使其很快清除，不能很好的發(fā)揮其生物學(xué)功能，因此在臨床應(yīng)用中受到限制；第二代抗體是在鼠單抗基礎(chǔ)上，通過(guò)基因重組形成了嵌合式抗體和人源化抗體，但兩者應(yīng)用于人體依舊存在免疫原性問(wèn)題；目前，人們正致力于第三代抗體即全人源性單克隆抗體的研究，主要采用噬菌體展示技術(shù)(phagedisplay)結(jié)合基因工程技術(shù)，由此產(chǎn)生的多株人源性單克隆抗體已經(jīng)成功地應(yīng)用于臨床疾病的治療。特別是在腫瘤治療領(lǐng)域，迄今為止，美國(guó)FDA已經(jīng)批準(zhǔn)了 12種單克隆抗體藥物上市，成為全球生物制藥領(lǐng)域的熱點(diǎn)。噬菌體展示技術(shù)最初由Smith于1985年創(chuàng)建，噬菌體作為一種表達(dá)載體將多肽展示于病毒外殼。基本原理是將外源DNA插入到絲狀噬菌體的基因組DNA中，使外源DNA編碼的肽段得以表達(dá)并伸展到噬菌體表面。通過(guò)采用與固定配體相互作用的親和篩選方法，可以富集得到能表達(dá)某種特異肽序列的曬菌體。曬菌體(口1^86)和卩遼菌粒(口1^861]11(1)都可作為表達(dá)載體來(lái)展示抗體或其他蛋白。噬菌粒攜帶表達(dá)gin外殼的基因、克隆位點(diǎn)及噬菌體包裝信號(hào)，并由輔助噬菌體(如M13K07或VCS-M13)提供完成包裝所需的結(jié)構(gòu)蛋白。含有完整噬菌體基因組的絲狀噬菌體常用來(lái)構(gòu)建肽庫(kù)，而噬菌粒能夠展示大量重組蛋白，更易于產(chǎn)生可溶性蛋白，同時(shí)自身不易受異源基因影響，因此在噬菌體抗體庫(kù)構(gòu)建中占據(jù)主導(dǎo)地位?？贵w片段是首次在曬菌體表面成功展示的蛋白質(zhì)。1990年，McCafferty等采用PCR方法擴(kuò)增出完整的抗體可變區(qū)基因，將多樣性可變區(qū)基因組裝到表達(dá)載體內(nèi)，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并最終表達(dá)到噬菌體表面，從而得到多樣性噬菌體抗體集合，即噬菌體抗體庫(kù)。噬菌體展示抗體技術(shù)可以制備全人源的抗體，是將抗體基因克隆到絲狀噬菌體的基因組DNA中，與噬菌體的外殼蛋白形成融合蛋白，從而使異源分子展示于噬菌體表面。主要特點(diǎn)是將特定的分子的基因型和表達(dá)型同時(shí)出現(xiàn)在一個(gè)噬菌體顆粒內(nèi)，通過(guò)DNA測(cè)序可以獲得特定展示抗體片段的基因序列信息，并可用特定的靶抗原篩選出特異性的噬菌體抗體；在此基礎(chǔ)上，可以通過(guò)基因工程的方法，在大腸桿菌表達(dá)可以得到大量表達(dá)的抗體。噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)模擬了人類B細(xì)胞的分化成熟過(guò)程，首先通過(guò)分子生物學(xué)手段將人類抗體的重鏈和輕鏈等功能基因連接起來(lái)，插入噬菌體載體上，使其展示在噬菌體表面。目前，最受關(guān)注的卩遼菌體展示的抗體分子，主要包括抗體結(jié)合片段(fragment antigenbinding, Fab)、單鏈抗體(single-chain variable fragment, scFv)等。相對(duì)于完整的抗體分子，F(xiàn)ab和scFv等小分子片段結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單(不存在Fe段)，組織穿透率高，并且能夠在原核生物中高效表達(dá)。其中scFv是目前報(bào)導(dǎo)最多的一種小分子抗體，是由抗體識(shí)別抗原的可變區(qū)Fv段組成。scFv由重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)通過(guò)連接區(qū)(linker)連接而成。所加的linker很重要,必須不影響scFv的構(gòu)象。將scFv基因克隆在絲狀曬菌體載體pill基因先導(dǎo)序列和PlII基因之間，以融合蛋白的形式被導(dǎo)入細(xì)菌膜間隙，并組裝成scFv，在加入輔助噬菌體M13K07后，scFv以融合蛋白的形式表達(dá)在噬菌體表面。pCANTAB_5E載體的特點(diǎn)是，在scFv基因后面含有一段編碼Tag尾肽(E-Tag)的序列，在E-Tag后面有一個(gè)琥珀(Amber)終止密碼，位于scFv基因與pill基因之間，在抑制性細(xì)菌TGl中，這種琥珀密碼子只有20%有效，所以在蛋白翻譯過(guò)程中可以被通讀而形成scFv-pIII融合蛋白；而在非抑制性菌株中，如HB2151，此終止子被識(shí)別，同時(shí)scFv基因在pill基因前終止，形成獨(dú)立的抗體蛋白，滯留于細(xì)胞膜間隙，并在長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)后釋放于培養(yǎng)液中，形成可溶性表達(dá)。再用特定的腫瘤相關(guān)抗原，通過(guò)“吸附-洗脫-擴(kuò)增”的淘篩過(guò)程(panning)，可篩選出特異性單鏈抗體
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)目的是提供一種白血病單鏈抗體庫(kù)，即噬菌體單鏈抗體庫(kù)，含有全套人類抗體重鏈可變區(qū)VH和輕鏈可變區(qū)VL(包括V K和VX)，及中間連接區(qū)linker序列為(GGGGS)3，有完整的抗原結(jié)合部位，以噬菌粒pCANTAB-5E為載體，庫(kù)容達(dá)到I. 5X 109。經(jīng)DNA序列分析后證明其多樣性良好，并且可以通過(guò)感染宿主(大腸細(xì)菌TGl)進(jìn)行大量擴(kuò)增和再生。利用特定的白血病細(xì)胞的靶抗原，可以通過(guò)噬菌體展示的方法，方便地篩選出白血病特異的單鏈抗體，進(jìn)而用于白血病的靶向治療。本專利技術(shù)的另一個(gè)目的是提供一種白血病單鏈抗體庫(kù)的構(gòu)建方法，通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)(I)總RNA提取和cDNA的合成取白血病患者的血液，分離淋巴細(xì)胞，用裂解液裂解淋巴細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄PCR (RT-PCR)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。這一步中，我們直接采用人類的淋巴細(xì)胞作為抗體基因的來(lái)源，可以獲得全人源的單鏈抗體，可以避免其它動(dòng)物來(lái)源抗體作為藥物在人類使用中的免疫原性和過(guò)敏反應(yīng)；同時(shí)，因?yàn)椴捎昧硕喾N白血病患者的樣本，提高了單鏈抗體庫(kù)的多樣性。(2)用PCR方法擴(kuò)增抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)基因根據(jù)人類抗體基因序列，分別設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增抗體重鏈、輕鏈可變區(qū)所需的特定引物，共32條，引物序列如SEQ ID NO. 1-32所示；以步驟(I)獲得的cDNA為模板，用PCR方法擴(kuò)增可變區(qū)基因VH和VL (包括V k和V入)。這一步中，我們?cè)O(shè)計(jì)的引物包含了不同免疫球蛋白家族的抗體類型，使之可以克隆人類全套VH和VL基因。(3)單鏈抗體(SCFv)基因片段的組裝和全長(zhǎng)擴(kuò)增設(shè)計(jì)含有由四個(gè)甘氨酸和一個(gè)絲氨酸組成的重復(fù)3次的連接肽(linker)序列和酶切位點(diǎn)SfiI、NotI的引物,所述連接肽和酶切位點(diǎn)SfiI、NotI的引物序列如SEQ ID NO. 33-64所示，在上述擴(kuò)增的重鏈(VH)和輕鏈(VL)可變區(qū)基因的基礎(chǔ)上，再經(jīng)重疊PCR (SOE-PCR)獲得scFv基因。在這一步中，我們使用的linker序列很重要，其結(jié)構(gòu)不會(huì)影響scFv的構(gòu)象，有利于其活性發(fā)揮。(4)重組噬菌粒的構(gòu)建分別用SfiI、NotI雙酶切scFv基因片段，將其插入噬菌粒載體PCANTAB-5E，構(gòu)建重組噬菌粒(見(jiàn)圖1)，轉(zhuǎn)化感受態(tài)E. coli TG1，經(jīng)輔助噬菌體M13K07超感染，獲得單次的噬菌體抗體庫(kù)；經(jīng)重復(fù)轉(zhuǎn)化后，獲得全人源白血病單鏈抗體庫(kù)(噬菌體單鏈抗體庫(kù))，庫(kù)容達(dá)到1.5X109。在這一步中，我們采用了重復(fù)轉(zhuǎn)化的策略，即制備足夠量的重組噬菌粒，經(jīng)過(guò)100多次的轉(zhuǎn)化E. coli TG，并采用電轉(zhuǎn)化的方式大大提高轉(zhuǎn)化的效率，得到較大庫(kù)容量的單鏈抗體庫(kù)。(5)單鏈抗體庫(kù)的多樣性分析隨機(jī)挑取多個(gè)單克隆菌，測(cè)定插入?yún)^(qū)scFv基因的DNA序列，經(jīng)ClustaIW序列比對(duì)軟件分析其序列的相似性，判斷單鏈抗體庫(kù)的多樣性分析；證明其多樣性良好。本專利技術(shù)的再一個(gè)本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種白血病單鏈抗體庫(kù)，其特征在于：該抗體庫(kù)含有全套人類抗體重鏈可變區(qū)VH和輕鏈可變區(qū)VL，及中間連接區(qū)linker序列為(GGGGS)3，有完整的抗原結(jié)合部位，以噬菌粒pCANTAB?5E為載體，庫(kù)容達(dá)到1.5×109。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種白血病單鏈抗體庫(kù)，其特征在于該抗體庫(kù)含有全套人類抗體重鏈可變區(qū)VH和輕鏈可變區(qū)VL，及中間連接區(qū)linker序列為(GGGGS) 3，有完整的抗原結(jié)合部位，以噬菌粒PCANTAB-5E為載體，庫(kù)容達(dá)到I. 5X 109。2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種白血病單鏈抗體庫(kù)的構(gòu)建方法，其特征在于通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn) (1)總RNA提取和cDNA的合成取白血病患者的血液，分離淋巴細(xì)胞，用裂解液裂解淋巴細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄PCR逆轉(zhuǎn)錄為cDNA ； (2)用PCR方法擴(kuò)增抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)基因根據(jù)人類抗體基因序列，分別設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增抗體重鏈、輕鏈可變區(qū)所需的特定引物，共32條，序列如SEQ ID NO. 1-32所示；以步驟(I)獲得的cDNA為模板，用PCR方法擴(kuò)增可變區(qū)基因VH和VL，包括Vk和V λ ； (3)單鏈抗體scFv基因片段的組裝和全長(zhǎng)擴(kuò)增設(shè)計(jì)含有由四個(gè)甘氨酸和一個(gè)絲氨酸組成的重復(fù)3次的連接肽序列和酶切位點(diǎn)Sfil、NotI的引物，在上述擴(kuò)增的重鏈VH和輕鏈VL可變區(qū)基因的基礎(chǔ)上，再經(jīng)重疊PCR獲得scFv基因； (4)重組噬菌粒的...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：詹金彪，范娜娜，張珍珍，林莉，湯沁，代爭(zhēng)，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：浙江大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：