本發(fā)明專利技術(shù)公開一種用于同時(shí)檢測miRNAs與蛋白標(biāo)記物的硅納米線芯片，包括至少一種單鏈DNA探針在硅納米線陣列中的集成排布以及蛋白標(biāo)記物抗體在硅納米線陣列中的集成排布。本發(fā)明專利技術(shù)還公開所述硅納米線芯片的結(jié)構(gòu)及制備工藝。本發(fā)明專利技術(shù)還公開所述硅納米線芯片用于同時(shí)檢測miRNAs與蛋白標(biāo)記物的檢測方法以及在檢測急性心肌梗塞miRNAs中的應(yīng)用。本發(fā)明專利技術(shù)實(shí)現(xiàn)快速同時(shí)檢測急性心肌梗塞miRNAs與蛋白標(biāo)記物，具有靈敏度高、檢測速度快、易于集成、高通量、穩(wěn)定性高、抗污染等優(yōu)點(diǎn)。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及生物分子檢測領(lǐng)域，特別涉及一種同時(shí)檢測miRNAs與蛋白標(biāo)記物的硅納米線芯片及其制備方法、檢測方法及應(yīng)用。
技術(shù)介紹
目前，心血管病是威脅人類健康的常見病高發(fā)病，而急性心肌梗塞則因?yàn)榘l(fā)病迅猛、致死率及致殘率高，給社會及患者家庭造成極大負(fù)擔(dān)。如果要降低急性心肌梗塞的危害，早期診斷、針對性治療以及根據(jù)病程進(jìn)展調(diào)整用藥等是必不可少的環(huán)節(jié)，而檢測及監(jiān)控某些生物標(biāo)記物顯然有助于這幾方面的實(shí)施。除了目前臨床上常用的幾種蛋白標(biāo)記物 cTnT、cTnI、CK-MM和CK-MB，近年來微小核糖核酸(microRNAs，miRNAs)被認(rèn)為是很有應(yīng)用前景的生物標(biāo)記物。按2000年歐洲心臟病學(xué)會和美國心臟病學(xué)會對心機(jī)梗死的定義，急性、演變中或新近心肌梗死診斷條件具備下列任何條件之一心肌生化標(biāo)志的典型升高和逐漸下降 (cTnT或cTnl)或較快增高和下降(CK-MB)，至少伴有下列情況之一者心肌缺血癥狀；心電圖出現(xiàn)病理性Q波；心電圖示心肌缺血(ST段抬高或壓低)；冠心動脈介入術(shù)(如冠狀動脈成形術(shù))。但即使是目前國際上通行診斷金標(biāo)準(zhǔn)cTn通常在心肌損傷4-8小時(shí)后升高，因而建議如果在入院時(shí)(有心肌缺血癥狀約I小時(shí))檢測cTn水平未升高，則需在6-9小時(shí)后再次抽血檢測，甚至需要在12-24小時(shí)后第三次檢測。因而如果要早期診斷急性心梗，需要檢測一些更早期即出現(xiàn)顯著性變化的分子標(biāo)記物。近年未有研究顯示某些miRNAs可在急性心梗后早期出現(xiàn)變化，提示了 miRNAs作為診斷指標(biāo)的可能性。例如D’ Alessandra等人采集了 33例急性心肌梗死患者的血衆(zhòng),TaqMan Human MicroRNA A and B Arrays篩選急性心梗后8倍以上變化的miRNAs并用實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證，最后選擇了 6個(gè)miRNAs進(jìn)一步研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)急性心梗后3小時(shí)內(nèi)即有miRNAs升高，其中miR-1，miR-133a, miR-133b, miR-122和miR-375的峰值比目前診斷用的“金標(biāo)準(zhǔn)”心肌肌I丐蛋白(cardiac troponin, cTn)更早出現(xiàn)。Wang等人則針對性選擇了肌肉富含的miR-1、miR-133a、miR_499和心肌特異性的miR-208a進(jìn)行研究。在結(jié)扎法大鼠AMI模型中，miR_208a在術(shù)后I小時(shí)即顯著升高。而在臨床病例中，AMI (33例)患者這四種血漿miRNAs比健康對照(30例)、非AMI型冠心病(16例)以及其它心血管病(17例)都明顯升高。更重要的是miR-208a在非AMI 患者中不能檢測到，而在AMI病例癥狀發(fā)生4小時(shí)后可100%檢測到。之后有更多研究報(bào)道 miR-1、miR-133、miR-328、miR-499_5p等對于AMI的診斷價(jià)值。因?yàn)閙iRNAs變化出現(xiàn)更早，而且miRNAs本身也比較穩(wěn)定，因而用miRNAs作為AMI診斷指標(biāo)是相當(dāng)有前景的。微小RNAs (microRNAs,簡稱miRNAs)是一類非編碼的RNA分子，長度在18-25核苷酸。近年來miRNAs對各種疾病的診斷價(jià)值越來越受到重視。雖然隨著現(xiàn)代芯片技術(shù)的應(yīng)用，可以靈敏地檢測出在疾病中miRNAs表達(dá)譜的變化。然而其檢測仍然存在以下缺陷檢測樣品需經(jīng)繁瑣的步驟處理，包括細(xì)胞、組織或血液樣品中總RNA的富集抽提及純化，而后經(jīng)反轉(zhuǎn)錄成cDNA，某些情況下還需PCR擴(kuò)增，方可上樣檢測。而究其根本原因，則在于細(xì)胞、 組織或血樣中miRNAs含量很低，經(jīng)常在pM-fM級，超出目前的檢測方法的極限低值。而且生物樣品中的其它復(fù)雜成分，例如糖、脂質(zhì)、金屬離子、大分子蛋白質(zhì)等，也會干擾目標(biāo)miRNA 與探針的結(jié)合，從而對檢測的靈敏度和特異性產(chǎn)生重大影響。繁瑣的前期處理過程是目前制約生物芯片在臨床大規(guī)模使用的瓶頸之一。最近的基于納米技術(shù)的場效應(yīng)F E T的硅納米線陣列(SiNW)芯片則有望通過提高檢測靈敏度解決這個(gè)難題。以SiNW結(jié)構(gòu)為核心，采用場效應(yīng)晶體管實(shí)現(xiàn)信號采集和放大，能夠更有效檢測目標(biāo)信號。此種芯片具有靈敏度高、檢測速度快、易于集成與高通量檢測的優(yōu)點(diǎn)。因此，本專利技術(shù)不僅解決硅納米線陣列保存應(yīng)用中存在的容易受污染問題，且使其在生物檢測中，即使待測組份本體液的呈現(xiàn)多樣性的情況下，也同樣可以使芯片面對Na、K、 Fe、Cu和Ca等離子的擴(kuò)散污染的考驗(yàn)以及PH值等多種化學(xué)因素的影響，即實(shí)現(xiàn)了檢測的高穩(wěn)定性。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)克服現(xiàn)有技術(shù)的以上缺陷，提出一種用于同時(shí)檢測miRNAs與蛋白標(biāo)記物的硅納米線芯片，可用于同時(shí)檢測復(fù)雜生物樣品中miRNAs和蛋白標(biāo)記物，從而早期診斷急性心梗相關(guān)的miRNAs標(biāo)記物。本專利技術(shù)提供一種同時(shí)檢測miRNAs與蛋白標(biāo)記物的硅納米線芯片，所述芯片包括: 至少一種單鏈DNA探針在硅納米線陣列中的集成排布，以及蛋白標(biāo)記物抗體在硅納米線陣列中的集成排布。本專利技術(shù)中，所述單鏈DNA探針包括針對特定miRNAs的完全匹配探針、單堿基不匹配探針、陰性對照探針、線蟲cel-39探針。本專利技術(shù)中，所述針對特定miRNAs 探針包括 miR-1、miR_133a、miR-145、miR_146a、 miR-206、miR_208a、miR-21、miR_29a、miR-499 探針。本專利技術(shù)中，所述蛋白標(biāo)記物抗體包括針對cTnT、cTnl、CK-MM、CK-MB的特異性抗體、陰性對照抗體、牛血清白蛋白抗體。本專利技術(shù)硅納米線生物檢測芯片包括半導(dǎo)體襯底、生長在半導(dǎo)體襯底上的二氧化硅隔離層、生長在二氧化硅隔離層上的多晶硅層、和生長在多晶硅層上的鈍化層；其中，多晶硅層中包括圖形化形成的硅納米線陣列；鈍化層的結(jié)構(gòu)為從下至上依次包括SiON層、TaN 層和Ta2O5層，且TaN/Ta205層僅覆蓋于硅納米線陣列中各硅納米線的表面和側(cè)壁。本專利技術(shù)硅納米線生物檢測芯片中，所述二氧化硅隔離層的厚度為1000 A- 5000 Ac 所述多晶硅層厚度為5<) Α-Ι000 A。所述硅納米線的線寬范圍為5nm 130nm;其厚度為 5nm IOOnm。所述SiON層的厚度為10 A- 50 A;所述TaN層的厚度為10 A 50 A;所述Ta205 層的厚度為10人 50 A。本專利技術(shù)還提供一種用于同時(shí)檢測miRNAs與蛋白標(biāo)記物的硅納米線芯片的制備方法，包括如下步驟步驟SOl :提供半導(dǎo)體襯底；步驟S02 :在所述半導(dǎo)體襯底上生長二氧化硅隔離層；步驟S03 :在所述二氧化硅隔離層上生長多晶硅層；步驟S04 :圖形化所述多晶硅層以形成硅納米線陣列；步驟S05 :在所述硅納米線陣列上生長一定厚度的鈍化層，其中，所述鈍化層結(jié)構(gòu)從上至下依次包括SiON層和TaN/Ta205層；步驟S06 :去除硅納米線陣列中各硅納米線之間的TaN/Ta205層。本專利技術(shù)制備方法中，所述步驟S02中的所述二氧化硅隔離層生長工藝為濕氧氧化工藝。本專利技術(shù)制備方法中，所述步驟S04中的形成硅納米線陣列是通過等離子干法刻蝕工藝完成的。本專利技術(shù)制備方法中，所述步驟S05中的SiON層是通過熱氧化法在硅納米線陣列表面生長形成，所述TaN/Ta205層是通過原子層淀積工藝生長形成的。本專利技術(shù)制備方法中，所述步驟S06中的去除工藝是采用等離子干法刻蝕工藝。本專利技術(shù)還提供了一本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種用于同時(shí)檢測miRNAs與蛋白標(biāo)記物的硅納米線芯片，其特征在于，所述芯片包括：至少一種單鏈DNA探針在硅納米線陣列中的集成排布，以及蛋白標(biāo)記物抗體在硅納米線陣列中的集成排布。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：趙宇嵐，朱建軍，何靖，蔣賓，
申請(專利權(quán))人：華東師范大學(xué)，上海集成電路研發(fā)中心有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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