本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種評(píng)價(jià)棉鈴蟲抗性治理效果的方法。該方法包括以下步驟：1）選擇兩種用于治理棉鈴蟲的藥物；2）接種敏感或抗性棉鈴蟲幼蟲；3）觀察幼蟲死亡情況，計(jì)算死亡率；4）建立二因素D-飽和方法建立回歸方程，評(píng)價(jià)兩種藥物的治理效果。本發(fā)明專利技術(shù)方法可操作性強(qiáng)，準(zhǔn)確高效，可在Bt蛋白或其他蛋白防治害蟲和治理抗性的效果評(píng)價(jià)中廣泛應(yīng)用。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及生物檢測(cè)領(lǐng)域，具體地，涉及。
技術(shù)介紹
棉花是關(guān)系國計(jì)民生的戰(zhàn)略物資，也是僅次于糧食的第二大農(nóng)作物。棉鈴蟲是危害棉田的主要害蟲之一，上世紀(jì)90年代初棉鈴蟲的大爆發(fā)給我國的國民經(jīng)濟(jì)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。為了有效的防治棉鈴蟲，1996年轉(zhuǎn)基因棉花在美國商業(yè)化種植，之后其種植面積在世界范圍內(nèi)快速增長，我國1997年由河北省開始引種美國Bt-CrylAc抗蟲棉，1999 年國產(chǎn)抗蟲棉開始商業(yè)化種植。2001年以前Bt棉花主要種植于黃河流域棉區(qū)，種植面積約50萬公頃，到2006年已廣泛種植于各個(gè)棉區(qū)，面積達(dá)400萬公頃，占全國棉花種植面積的70%，2011年中國的轉(zhuǎn)基因棉花種植比例達(dá)到71. 5%。轉(zhuǎn)Bt棉花的廣泛種植在帶來巨大收益的同時(shí)，害蟲對(duì)Bt的抗藥性也成為一個(gè)不容忽視的問題。Tabashnik等2008年報(bào)道美國的東南部棉鈴蟲在田間對(duì)Bt棉產(chǎn)生了抗性； Tabashnik等2010報(bào)道印度從2002年開始使用第一代轉(zhuǎn)基因棉花，到2009年田間的紅鈴蟲已對(duì)CrylAc產(chǎn)生了抗性。很多國際育種公司先后開發(fā)了第二代轉(zhuǎn)基因棉花，如Monsanto 公司的 Bollgard II (表達(dá) Cry2Ab 和 CrylAc 蛋白)，DowAgroSciences 公司的 WideStrike (表達(dá)CrylF和CrylAc蛋白)，Syngenta公司的VipCot (表達(dá)Vip3A和CrylAb蛋白)等。轉(zhuǎn)雙價(jià)基因抗蟲棉花除擴(kuò)大殺蟲譜外，還可以起到延緩靶標(biāo)害蟲抗性發(fā)展的作用。因此，新蛋白的選擇基本原則是表達(dá)的兩種蛋白之間不存在交互抗性，評(píng)價(jià)新蛋白與抗性棉鈴蟲的交互抗性及蛋白間的協(xié)同作用，對(duì)未來轉(zhuǎn)雙價(jià)基因抗蟲棉花的推廣具有重要影響。轉(zhuǎn)基因植物的制備過程是一個(gè)復(fù)雜漫長的過程，受多種因素的影響，轉(zhuǎn)基因植物由于基因突變等影響，其效果具有不確定性，需要進(jìn)行大量篩選工作。因此，在新基因轉(zhuǎn)入棉花前， 在室內(nèi)對(duì)其新型蛋白的效果進(jìn)行評(píng)價(jià)可以節(jié)省大量的人力、物力、財(cái)力。目前主要是采用多次生物測(cè)定的方法分別測(cè)定新蛋白對(duì)棉鈴蟲的防治效果、新蛋白對(duì)抗性棉鈴蟲的治理效果、兩種蛋白混用對(duì)敏感棉鈴蟲的增效；沒有評(píng)價(jià)兩種蛋白混用對(duì)抗性棉鈴蟲的治理效果。因此迫切需要一種通過一次生物測(cè)定，就可以評(píng)價(jià)兩種蛋白混用治理棉鈴蟲的效果O
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)目的是提供，用于簡單、快速、高效的全面評(píng)價(jià)兩種蛋白的作用效果。本專利技術(shù)通過二因素D-飽和最優(yōu)試驗(yàn)設(shè)計(jì)、采用表面涂抹法對(duì)敏感和抗性棉鈴蟲初孵幼蟲分別進(jìn)行生物測(cè)定，根據(jù)回歸方程，對(duì)兩種蛋白的作用效果、主要作用因子、最優(yōu)的濃度組合進(jìn)行分析。具體地，所述方法包括以下步驟I)選擇兩種用于治理棉鈴蟲的藥物；2)接種敏感或抗性棉鈴蟲幼蟲；3)觀察幼蟲死亡情況，計(jì)算死亡率；4)建立二因素D-飽和方法建立回歸方程，評(píng)價(jià)兩種藥物的治理效果。其中，所述藥物為Cry2Ab蛋白、CryIAb蛋白、CrylF蛋白、Vip3A蛋白和CrylAc蛋白等中的任意兩種。所述藥物的濃度為0-4. 760 μ g/cm2。其中，所述棉鈴蟲幼蟲的接種量為24頭以上棉鈴蟲幼蟲/單位體積藥物。所述棉鈴蟲幼蟲培養(yǎng)的人工飼料為改進(jìn)的棉鈴蟲飼料，飼料組成包括玉米粉、黃豆粉、酵母粉、蔗糖、維生素(具體配方參照《人工飼養(yǎng)棉鈴蟲技術(shù)的改進(jìn)》中的配方4，植物保護(hù)，梁革梅等， 1999 );所述棉鈴蟲幼蟲培養(yǎng)的條件為溫度27 ± 2°C，濕度75 土 10%，光照14:10 (L: D) h。對(duì)于敏感品系棉鈴蟲，建立回歸方程夕=9.04+.1.83X!+0.31x2-1J9 xf-0.80 χ22-0.808 χ,χ2, χ代表第一種藥物濃度編碼值，χ2代表第二種藥物濃度編碼值、f 代表理論死亡率，當(dāng)回歸方程的差異顯著性分析達(dá)到顯著水平時(shí)(F>F O. 05)，表明實(shí)際死亡率與》 吻合，回歸方程能反應(yīng)實(shí)際情況；當(dāng)兩因素的回歸系數(shù)差異顯著時(shí)(t>t O. 05)，表明兩種藥物作用顯著；將兩因素的回歸系數(shù)絕對(duì)值大小，絕對(duì)值大的為起主要作用的藥物； 通過交互效應(yīng)、最優(yōu)濃度配比分析，得到兩種藥物作用的最佳濃度配比。優(yōu)選地,所述兩種藥物為CrylAc蛋白和Cry2Ab蛋白時(shí),其治理敏感棉鈴蟲濃度均為1. 75-3. 65 μ g/cm2。對(duì)于BtR品系棉鈴蟲，建立回歸方程f-5.383+0.473xl+0.526x2-0.105xl2-0,474 x22-0.0lSlxU2；xl 代表第一種藥物濃度編碼值，x2代表第二種藥物濃度編碼值、彳代表理論死亡率，當(dāng)回歸方程的差異顯著性分析達(dá)到顯著水平時(shí)(F>F O. 05)，表明實(shí)際死亡率與f 吻合，回歸方程能反應(yīng)實(shí)際情況；當(dāng)兩因素的回歸系數(shù)差異顯著時(shí)(t>t O. 05)，表明兩種藥物作用顯著；將兩因素的回歸系數(shù)絕對(duì)值大小，絕對(duì)值大的為起主要作用的藥物；通過交互效應(yīng)、最優(yōu)濃度配比分析，得到兩種藥物作用的最佳濃度配比。優(yōu)選地,所述兩種藥物為CrylAc蛋白和Cry2Ab蛋白時(shí),其治理BtR品系CrylAc 抗性棉鈴蟲的最佳濃度配比為CrylAc蛋白濃度為2. 49-4. 23 μ g/cm2, Cry2Ab蛋白濃度為1. 10-4. 28 μ g/cm2。本專利技術(shù)實(shí)施例中還進(jìn)一步提供以下具體地實(shí)施方案I)供試棉鈴蟲敏感品系和BtR品系CrylAc抗性品系棉鈴蟲的初鮮幼蟲。2)兩種Bt蛋白的濃度配比利用二因素D-飽和最優(yōu)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，針對(duì)兩種蛋白因素，按下表的濃度設(shè)計(jì)3次重復(fù)的飽和試驗(yàn)，進(jìn)行生物測(cè)定。表I 二因素的編碼及濃度設(shè)置權(quán)利要求1.，包括以下步驟 1)選擇兩種用于治理棉鈴蟲的藥物； 2)接種敏感或抗性棉鈴蟲幼蟲； 3)觀察幼蟲死亡情況，計(jì)算死亡率； 4)建立ニ因素D-飽和方法建立回歸方程，評(píng)價(jià)兩種藥物的治理效果。2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述藥物為Cry2Ab蛋白、CrylAc蛋白、CrylF蛋白、Vip3A蛋白和CrylAb蛋白中的任意兩種。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述藥物的濃度為0-4.760 μ g/cm2。4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述棉鈴蟲幼蟲的培養(yǎng)條件為溫度27±2°C，濕度 75 ±10%，光照 14: IOh。5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，對(duì)于敏感品系棉鈴蟲，建立回歸方程1=9,04+1.831-0,31^-1.891^-0,801/-0.^8 X1X2J1 代表第一種藥物濃度編碼值，χ2代表第二種藥物濃度編碼值、$代表理論死亡率； 當(dāng)回歸方程的差異顯著性分析達(dá)到顯著水平時(shí)，表明實(shí)際死亡率與f吻合，回歸方程能反應(yīng)實(shí)際情況； 當(dāng)兩因素的回歸系數(shù)差異顯著時(shí)，表明兩種藥物作用顯著； 將兩因素的回歸系數(shù)絕對(duì)值大小相比，絕對(duì)值大的為起主要作用的藥物； 通過交互效應(yīng)、最優(yōu)濃度配比分析，得到兩種藥物作用的最佳濃度配比。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法,其特征在于，所述兩種藥物為CrylAc蛋白和Cry2Ab蛋白。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法,其特征在于,CryIAc蛋白和Cry2Ab蛋白治理敏感品系棉鈴蟲的濃度均為I. 75-3. 65 μ g/cm2。8.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，對(duì)于B本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種評(píng)價(jià)棉鈴蟲抗性治理效果的方法，包括以下步驟：1）選擇兩種用于治理棉鈴蟲的藥物；2）接種敏感或抗性棉鈴蟲幼蟲；3）觀察幼蟲死亡情況，計(jì)算死亡率；4）建立二因素D?飽和方法建立回歸方程，評(píng)價(jià)兩種藥物的治理效果。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：梁革梅，魏紀(jì)珍，張麗麗，高珍，張永軍，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，
類型：發(fā)明
國別省市：
還沒有人留言評(píng)論。發(fā)表了對(duì)其他瀏覽者有用的留言會(huì)獲得科技券。