一種毛柄金錢菌菌株及制備方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及毛柄金錢菌菌株的篩選及制備方法，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明專利技術(shù)的菌株FlammulinavelutipesKML-19已于2012年10月11日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCCNO.6704。利用該菌株制備的液體及固體優(yōu)良菌種，應(yīng)用于毛柄金錢菌的促繁有著顯著的社會(huì)、經(jīng)濟(jì)效益和廣闊的應(yīng)用前景。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
一種毛柄金錢菌菌株及制備方法
本專利技術(shù)屬微生物
，具體涉及一種毛柄金錢菌菌株培養(yǎng)基及菌種制備方法。
技術(shù)介紹
毛柄金錢菌Flammulinavelutipes別名又稱毛柄小火菇、構(gòu)菌、樸菇、冬菇、樸菰、凍菌、金菇、智力菇等，屬傘菌目白蘑科金針菇屬。毛柄金錢菌營養(yǎng)豐富，清香撲鼻。其菌蓋小巧細(xì)膩，黃褐色或淡黃色或白嫩。不僅味道鮮美，而且營養(yǎng)豐富，是拌涼菜和火鍋食品的原料之一。在毛柄金錢菌栽培技術(shù)中，優(yōu)良菌種的獲得是關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)。毛柄金錢菌菌株的獲得通常是利用子實(shí)體或孢子進(jìn)行分離、純化，直接應(yīng)用于毛柄金錢菌的栽培或菌絲體生產(chǎn)。現(xiàn)有技術(shù)的不足在于其生物學(xué)特性目前仍處于試驗(yàn)研究階段，生物轉(zhuǎn)化率較低，而且還要用熟料栽培，生產(chǎn)工藝及技術(shù)要素要求較高，因而制約了毛柄金錢菌商品經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。另外只能根據(jù)菌絲形態(tài)及分離物來初步確定是否為毛柄金錢菌純培養(yǎng)物；生產(chǎn)的菌種一般用固體菌種。目前在國內(nèi)采用液體菌種進(jìn)行毛柄金錢菌資源的保護(hù)應(yīng)用不廣泛。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的主要目的就是克服現(xiàn)有技術(shù)不足，利用云南原產(chǎn)地毛柄金錢菌子實(shí)體篩選出優(yōu)良菌株，采用生物技術(shù)進(jìn)行菌種鑒定，制備毛柄金錢菌液體及固體優(yōu)良菌種，為毛柄金錢菌資源保護(hù)提供優(yōu)良菌種。本專利技術(shù)采用的真菌是毛柄金錢菌FlammulinavelutipesKML-19；保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；地址：中國北京市朝陽區(qū)大屯路；保藏日期：2012年10月31日；保藏登記入冊(cè)的編號(hào)CGMCCNO.6704。毛柄金錢菌的子實(shí)體由菌蓋、菌褶、菌柄三部分組成，多數(shù)成束生長，肉質(zhì)柔軟有彈性。菌蓋呈球形或呈扁半球形，直徑1.5～7厘米，幼時(shí)球形，逐漸平展，過分成熟時(shí)邊緣皺折向上翻卷。菌蓋表面有膠質(zhì)薄層，濕時(shí)有粘性，色黃白到黃褐，菌肉白色，中央厚，邊緣薄，菌褶白色或象牙色，較稀疏，長短不一，與菌柄離生或彎生。菌柄中央生，中空?qǐng)A柱狀，稍彎曲，長3.5～15厘米，直徑0.3～1.5厘米，菌柄基部相連，上部呈肉質(zhì)，下部為革質(zhì)，表面密生黑褐色短絨毛，擔(dān)孢子生于菌褶子實(shí)層上，孢子圓柱形，無色。本專利技術(shù)的技術(shù)方案：①采集野生毛柄金錢菌子實(shí)體；②組織分離或孢子分離；③純化菌株及菌株鑒定；④生物學(xué)特性比較及生產(chǎn)性狀比較；⑤確定優(yōu)良菌株；⑥菌種生產(chǎn)及菌種應(yīng)用；經(jīng)過反復(fù)篩選，獲得菌絲體產(chǎn)量高、抗污染的毛柄金錢菌液體菌種專用菌株KML-19。本專利技術(shù)真菌Flammulinavelutipes培養(yǎng)方法(以下為重量百分比):菌種分離純化培養(yǎng)基：2%毛柄金錢菌下腳料、0.001%VB1、2%葡萄糖、2%瓊脂；毛柄金錢菌菌株分離及鑒定方法：1、將毛柄金錢菌子實(shí)體組織塊或孢子液接種到上述試管瓊脂培養(yǎng)基斜面上，于18-24℃下培養(yǎng)5-10天，對(duì)分離培養(yǎng)的試管每天觀察記錄，及時(shí)剔除已污染的試管，挑選出無污染、長勢(shì)良好的菌株，獲得毛柄金錢菌分離試管種。2、將分離試管種菌絲塊接種到上述瓊脂培養(yǎng)基的平板培養(yǎng)皿上進(jìn)行菌種純化，2天后取尖端菌絲塊接種在培養(yǎng)基斜面上，于18-24℃下培養(yǎng)5-7天，獲得毛柄金錢菌純化試管種。3、采用供試子實(shí)體與對(duì)應(yīng)菌絲分離物，分別按SDS方法提取總DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增及ITS序列測定，通過Blast對(duì)比樣品的ITS序列與GENBANK中的毛柄金錢菌(Flammulinavelutipes)Identities=518/532(97%)，Gaps=8/532(1%)，分析確定分離得到的純培養(yǎng)物為毛柄金錢菌菌絲體。本專利技術(shù)毛柄金錢菌菌種的制備方法分為：液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)兩種。液體菌種制備方法：液體培養(yǎng)基配方為：10~20%麩皮、10~20%土豆、0.5~1%蔗糖、10%玉米粉，余下為水，pH自然。1、將毛柄金錢菌的菌絲體接種到試管瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)基配方為PDA培養(yǎng)基，于18-24℃下培養(yǎng)5-7天，獲得試管菌種。2、將試管種接種到500ml三角瓶（每瓶裝200ml）液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為前述液體培養(yǎng)基配方，于20-26℃下?lián)u床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為120-160r/min，培養(yǎng)時(shí)間5-7天。3、將搖瓶菌種接種到25L自動(dòng)發(fā)酵生產(chǎn)線的發(fā)酵罐中，通氣量為1：0.8v/(v·min)；攪拌轉(zhuǎn)速為120-160r/min；接種量為5-10%；罐壓：0.04Mpa；pH為6.0；溫度為20-26℃；通氣培養(yǎng)72-96小時(shí)，獲得毛柄金錢菌液體菌種。固體菌種制備方法：固體培養(yǎng)基配方為：棉籽殼90%、麩皮9%、碳酸鈣1%、pH自然。1、將毛柄金錢菌的菌絲體接種到試管瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)基配方為PDA培養(yǎng)基，于18-24℃下培養(yǎng)5-7天，獲得試管菌種。2、將試管種接種到500ml三角瓶（每瓶裝200ml）液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為前述液體培養(yǎng)基配方，于20-26℃下?lián)u床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為120-160r/min，培養(yǎng)時(shí)間5-7天。2、采用前述固體培養(yǎng)基配方。將培養(yǎng)料混合后，加水拌均勻后，裝入750ml的大口瓶中，壓緊封口后在120℃滅菌60分鐘，接入液體菌種，于20-26℃培養(yǎng)15-20天，直到菌絲長滿。具體實(shí)施方式實(shí)施例一：1、將毛柄金錢菌子實(shí)體組織塊接種到上述菌種分離純化培養(yǎng)基斜面上，于18℃下培養(yǎng)10天，對(duì)分離培養(yǎng)的試管每天觀察記錄，及時(shí)剔除已污染的試管，挑選出無污染、長勢(shì)良好的菌株，獲得毛柄金錢菌分離試管種。2、將分離試管種菌絲塊接種到上述瓊脂培養(yǎng)基的平板培養(yǎng)皿上進(jìn)行菌種純化，2天后取菌絲塊接種在培養(yǎng)基斜面上，于18℃下培養(yǎng)7天，獲得毛柄金錢菌純化試管種。3、采用供試子實(shí)體與對(duì)應(yīng)菌絲分離物，分別按SDS方法提取總DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增及ITS序列測定，通過Blast對(duì)比樣品的ITS序列與GENBANK中的毛柄金錢菌(Flammulinavelutipes)Identities=521/525(97%)，Gaps=2/525(0%)，分析確定分離得到的純培養(yǎng)物為毛柄金錢菌菌絲體。4、將FlammulinavelutipesKML-19的菌絲體接種到試管瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)基配方為PDA培養(yǎng)基，18℃下培養(yǎng)7天，獲得試管種。5、將試管種接種到500ml三角瓶中（每瓶裝200ml）液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為10%麩皮、10%土豆、0.5%蔗糖、10%玉米粉，余下為水，pH自然。于20℃下?lián)u床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為120rpm，培養(yǎng)時(shí)間7天，獲得一級(jí)液體菌種。將一級(jí)液體菌種接種到25L自動(dòng)發(fā)酵生產(chǎn)線的發(fā)酵罐中，通氣量為1：0.8v/(v·min)；攪拌轉(zhuǎn)速為120r/min；接種量為5%；罐壓：0.04Mpa；pH為6.0；溫度為22℃；通氣培養(yǎng)96小時(shí)，獲得毛柄金錢菌液體菌種。實(shí)施例二：菌種制備的步驟與實(shí)施例一相同。1、將毛柄金錢菌子實(shí)體組織塊接種到上述菌種分離純化培養(yǎng)基斜面上，于22℃下培養(yǎng)6天，對(duì)分離培養(yǎng)的試管每天觀察記錄，及時(shí)剔除已污染的試管，挑選出無污染、長勢(shì)良好的菌株，獲得毛柄金錢菌分離試管種。2、將分離試管種菌絲塊接種到上述瓊脂培養(yǎng)基的平板培養(yǎng)皿上進(jìn)行菌種純化，2天后取尖端菌絲塊接種在培養(yǎng)基斜面上，于22℃下培養(yǎng)6天，獲得毛柄金錢菌純化試管種。3、采用供試子實(shí)體與對(duì)應(yīng)菌絲分離物，分別按SDS方法提取總DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增及ITS序列測定，通過Blast對(duì)比樣品的ITS序列與GENBANK中的毛柄金錢菌本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種毛柄金錢菌菌株，其特征在于所述菌株為（Flammulina?velutipes）?KML?19，該菌株的保藏號(hào)為CGMCC??NO.6704。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種毛柄金錢菌菌種制備方法，其特征在于所述毛柄金錢菌的菌株為FlammulinavelutipesKML-19，該菌株的保藏號(hào)為CGMCCNO.6704，菌種培養(yǎng)基分為液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基，所述液體培養(yǎng)基配方為：10~20%麩皮、10~20%土豆、0.5~1%蔗糖、10%玉米粉，余下為水、pH自然；所述固體培養(yǎng)基配方為：棉籽殼90%、麩皮9%、碳酸鈣1%、pH自然；所述毛柄金錢菌菌種制備方法包括液體菌種培養(yǎng)和固體菌種培養(yǎng)，具體包括：A.將毛柄金錢菌的菌絲體接種到試管瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)基配方為PDA培養(yǎng)基，于18~24℃下培養(yǎng)5-7天，獲得試管菌種；B.將試管菌種接種到500m...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：張微思，郭永紅，羅孝坤，羅曉莉，尚陸娥，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：中華全國供銷合作總社昆明食用菌研究所，云南省供銷合作社科學(xué)研究所，昆明菌苑食品有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：