本發明專利技術提供一種新型免疫調節蛋白及其制備方法和應用，屬于生物技術領域。該蛋白為人類免疫缺陷病毒膜分子gp120功能域C2-C4部分的重組分子，本發明專利技術的pC2-C4能同細胞表面分子CD4分子相結合，激活和增強外周血靜止CD4+CD25+調節性T細胞的功能，為臨床治療自身免疫性疾病、移植相關疾病及相關腫瘤提供新的策略。
【技術實現步驟摘要】
一種新型免疫調節蛋白及其制備和應用
本專利技術屬于生物
，涉及一種基因重組及表達的促Treg活化蛋白及其制備方法和應用。
技術介紹
CD4+CD25+調節性 T 細胞(CD4+CD25+regulatory T cells, Tregs)是在研究自身免疫性疾病時發現的一類特殊的⑶4+T淋巴細胞亞群，表達⑶25、CTLA-4、GITR、⑶86和特征性的轉錄因子FoxP3，對維持和調節人體免疫平衡有重要作用。Tregs具有持久的免疫抑制活性。Tregs可識別自身抗原和外來抗原，非特異性抑制其它免疫相關細胞活性， 抑制不適當或過度的免疫反應，調節和維持免疫穩態，誘導免疫耐受。Tregs的特殊生物學功能，為臨床治療自身免疫性疾病和移植免疫相關疾病提供了新的思路。根據細胞發育過程、抗原特異性、活化機制和信號通路，Tregs分為天然型Treg細胞(nTregs)和誘生型 Treg細胞(iTregs)。天然Tregs占全部⑶4+細胞的5%-10%，在外周血不到2%，且只有 CD4+CD25bHgh+high orCD4+CD25+Fox3+T細胞才為具有免疫抑制的Tregs。因此，如何獲得足夠數量的有功能的Tregs成為其臨床應用的瓶頸。嘗試誘發或擴大Tregs的調節功能主要有兩種途徑分離有適應癥患者Tregs在體外擴增后回輸和利用相關媒介在體內增強Tregs 功能。后一方法需要一種生物制劑。尋求能在體內活化Tregs增強其抑制功能且無毒副作用的生物制劑成為研究的熱點。Jiaxiang(an additional · Int Tmmunol , 2009, 21 (3) :283-294)等分離健康人外周血⑶4+⑶25+T細胞使其感染人類免疫缺陷病毒I (HIV-1)并檢測Treg相關功能標記物， 研究發現，靜止的⑶4+CD25+T細胞感染有活性或滅活的HIV-1后，Treg特征性標記Fox3表達量增多，⑶4+CD25+T細胞的抑制功能增強了 2 5倍，且上調抗凋亡分子Bcl_2延長細胞生存，表達歸巢受體⑶62L和α 4β 7，誘導⑶4+⑶25+T在外周淋巴結和粘膜相關淋巴組織聚集。HIV引起的靜止⑶4+⑶25+Τ的生物學行為改變引起了人們的關注。HIV主要通過其包膜蛋白gpl20與Q34+T細胞表面0)4分子結合入侵人體。Christian Becker (Blood, 2009, 114(6 ) :1263-1269)等發現真核表達獲得的可溶性重組gpl20分子能夠與⑶4分子結合上調⑶4+⑶25+T細胞內cAMP，增強其抑制功能，單劑量輸注5 μ g gpl20輸入小鼠體內，足以能夠保護小鼠免死于致死性的移植物抗宿主病，說明游離的gpl20分子在體內外均與CD4分子結合，增強⑶4+⑶25+T細胞的抑制功能，可能為一種潛在的生物制劑。外膜蛋白gpl20由恒定區和高變區組成V1 V5區段為高變區，位于gpl20表面， Cl C5區為穩定區，主要位于gpl20核心區域。gpl20的第4恒定區(C4)與⑶4的MHC II分子結合部位結合，引起gpl20的構象改變，在其第3高變區(V3)發生蛋白水解，并通過細胞表面融合受體(fusion receptor)與跨膜蛋白gp41融合,使gp41暴露,從而使疏水性較強的gp41 —端插入靶細胞胞膜中，便于病毒胞膜與靶細胞膜融合，完成HIV侵入CD4+ 靶細胞。C4區是gpl20與⑶4結合的主要區域，V3區對HIV侵入有重要的輔助作用，此外， gpl20的第2恒定區(C2)、第3恒定區(C3)和第4高變區(V4)也有一定的輔助作用。OgertRA等研究發現HIV gpl20全長在大腸桿菌中很難得到表達，通過同源基因重組技術克隆對 AIDS治療藥物vicriviroc有抗性HIV gpl20的C2-V5區，證實C2-V5區與gpl20全長有同樣的生物學活性，對vicriviroc有100%的抗性。可見C2-V5區是gpl20活性中心。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供人類免疫缺陷病毒的被膜蛋白gpl20 C2-C4蛋白分子，簡稱 PC2-C4，其氨基酸序列優選如SEQ ID N0:1所示。本專利技術提供編碼pC2-C4蛋白的核酸序列，優選如SEQ ID NO 2所示。本專利技術還提供包含pC2-C4蛋白分子核酸序列的載體和宿主菌。本專利技術進一步提供制備pC2-C4蛋白分子的方法，包括克隆構建了 gpl20的 C2-V3-C3-V4-C4(為方便描述，以下核苷酸序列簡稱gC2_C4，翻譯的蛋白命名為pC2_C4)區 cDNA原核表達載體，在原核表達系統中獲得了以包涵體形式的高表達，純化獲得純度大于 90%的蛋白pC2-C4。原核表達的蛋白無活性，需在體外環境下復性，重新折疊形成正確的空間構象，恢復生物學活性。本專利技術的蛋白經體外復性后，恢復生物學活性，能夠與人T淋巴細胞白血病細胞 Hut78 和 jurkat clone E6-1 表面 CD4 分子結合。本專利技術獲得的蛋白可用于I)與HIV競爭性結合CD4，預防HIV感染；2)增加體內活化Treg細胞數量，增強Treg功能，用于治療自身免疫性疾病、移植物抗宿主病等免疫介導的相關疾病；3)抑制腫瘤細胞增殖并可誘導凋亡，用于防治腫瘤。相對于現有技術，本專利技術表現有以下特點 1、重組分子截取了 gpl20的C2-C4區,減小了分子量,避免因gpl20分子量大表達困難的問題；2、保留了 gpl20與⑶4結合主要結構域和輔助結構域，gpl20 C2-C4區特異性結合⑶4分子，具有靶向特異性，提高重組分子的轉化效率，gpl20 C2-C4與⑶4結合后，可活化體內靜止的⑶4+⑶25-T細胞，增強其抑制功能；3、蛋白pC2-C4分子量小，降低了蛋白的免疫原性；4、構建重組分子的原核表達系統，并融合6個HIS標簽，蛋白以包涵體形式表達， 具有蛋白表達量高、純度高、易于純化回收等優點。附圖說明圖1. gpl20結構簡式圖圖2. C2-C4區基因片段PCR和載體構建雙酶切鑒定M IOObp DNA marker ;lane1:C2_C4 per 結果電泳圖，與理論值大小相符；lane 2 :質粒pET28a-c2-c4 ；Lane 3 =BamHI和Sal雙酶切鑒定質粒pET28a_C2_C4，結果與理論值相符。圖3. SDS-PAGE凝膠電泳和western-blot鑒定蛋白表達A M :蛋白marker ；lane1:誘導前對照；lane 2 :誘導后全菌；lane 3 :誘導后上清；lane4 :包涵體溶解液；5 :純化后；B1 :western_blot檢測蛋白表達。圖4.免疫共沉淀法驗證蛋白與⑶4相互作用圖1:空白對照；2 Tca8113 陰性對照組；3 :Hut78 細胞組；4 Jurkat clone E6-1 cells細胞組。圖5.1. 5 μ mo I/L的重組蛋白pC2_C4對混合淋巴細胞反應的抑制作用(100X)A PBS 組:20h :32h :44h :56h :68h :80h ；B pC2-C4 組:20h !②32h :44h :56h :68h :80h ；圖6.1. 5 μ mol/L的重組蛋白pC2_C4對混合淋巴細本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種重組的新型免疫調節蛋白，其特征為該重組蛋白藥物氨基酸片段優選人類免疫缺陷病毒的被膜蛋白gp120，其機理為促Treg(CD4+CD25+調控T細胞)活化。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：曾令宇，徐開林，曹江，陳翀，齊共健，王東洋，張倩，張建軍，李振宇，程海，閆志凌，桑威，李德鵬，
申請(專利權)人：徐州醫學院附屬醫院，
類型：發明
國別省市：
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