一種利用光能生產乙醇的微生物制造技術

本發明專利技術提供了一種利用光合作用生產乙醇的基因工程藍藻，其含有整合到染色體上的外源丙酮酸脫羧酶基因和外源乙醇脫氫酶，所述丙酮酸脫羧酶基因編碼的丙酮酸脫羧酶具有點突變。本發明專利技術還提供了制備所述基因工程藍藻的載體和制備方法，以及使用所述基因工程藍藻制備乙醇的方法。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及可再生能源和生物
具體涉及一種經過基因工程修飾后可通過光合作用高效生產乙醇的微生物，以及所述基因工程修飾微生物的方法和運用此基因工程微生物制備乙醇的方法。
技術介紹
石化能源為國民經濟與社會發展的重要物質基礎，但石化能源具有稀缺性和不可再生性，隨著時間的推移，其價格必將因儲量的減少和開采量的下降而上漲。此外，電力行業高度依賴煤炭資源，是造成威脅著電力供應的“煤炭矛盾”長期存在的根本原因之一。 因此，可再生能源具有長遠的發展潛力和廣闊的市場前景?？稍偕茉串a業的發展必然對相關產業的發展起到帶動作用，這將使我國的國民經濟結構更加合理。目前的液體生物燃料主要有生物燃料乙醇和生物柴油。然而，生物燃料的快速發展面臨著糧食安全和土地淡水資源緊缺問題。現有技術通過燃料乙醇產業作為替代能源，但是，隨著燃料乙醇產量增加，糧食供給短缺和價格上漲導致以糧食為原料的生物能源產業不能持續性發展。近幾年大力發展的非糧燃料乙醇和生物質發電產業同樣受到客觀條件的制約，難以滿足大規模替代化石燃料的規模和成本要求。以木薯、甜高粱、纖維素為原料的燃料乙醇產業從本質上說是以種植業為基礎的，需要大規模投入可耕地、淡水、化肥以獲得較高產量，而這些資源均為稀缺資源，用于替代化石能源將對整體資源環境造成巨大壓力。因此，迫切需要開發不占用可耕地、淡水、化肥資源的新型生物能源技術，為可再生能源產業發展提供具備現實可行性的手段，切實有效減少二氧化碳排放，替代化石能源使用，促進基于化石能源的傳統工業體系向基于可再生能源的綠色工業體系轉化。對微生物進行基因工程改造來生產能源是能源產業中的一個發展方向。但現有技術中，工業上主要是利用具有乙醇代謝途徑的異養微生物，例如酵母和大腸桿菌等。藍藻是一種自養微生物，是目前地球上最廣泛的生物體。藍藻是單細胞生物，沒有細胞核，但細胞中央含有核物質，通常呈顆粒狀或網狀，染色質和色素均勻的分布在細胞質中。藍藻的細胞質中都有內膜系統，可以進行光合作用，產生自己所需要的物質，即可以自養。但是，自然存在的光合細菌藍藻通常不能利用陽光和二氧化碳合成乙醇，僅在避光和無氧條件下通過發酵產生少量乙醇。本領域已知生產乙醇的微生物(例如大腸桿菌，酵母菌，運動發酵單細胞菌等)中存在乙醇生產的代謝途徑。已知的乙醇生產代謝途徑是從糖酵解途徑的丙酮酸經過乙醛再到末端代謝產物乙醇，其中丙酮酸到乙醛的反應過程由丙酮酸脫羧酶(pyruvate decarboxylase, PDC)催化，乙醒到乙醇的反應過程由乙醇脫氫酶(alcoholdehydrogenase,ADH)催化控制。藍藻的基因組中不存在丙酮酸脫羧酶基因，因而不具有產生乙醇的能力。本專利技術提供了一種利用基因工程藍藻生產乙醇的方法，經過對野生藍藻的改造， 從而使得藍藻能夠直接利用太陽光和二氧化碳生產乙醇。
技術實現思路
本專利技術以藍藻為宿主，將外源乙醇代謝途徑的丙酮酸脫羧酶基因和乙醇脫氫酶基因導入藍藻，形成具有穩定遺傳性狀和較高乙醇產率的基因工程菌株，使得改造的藍藻菌株能夠利用陽光、水和二氧化碳生產乙醇。本專利技術還提供了基因工程藍藻通過光合作用利用陽光、水和二氧化碳制備乙醇的方法。本專利技術提供了一種利用光合作用生產乙醇的基因工程藍藻，其含有整合到染色體上的外源丙酮酸脫羧酶基因和乙醇脫氫酶基因。外源丙酮酸脫羧酶基因和乙醇脫氫酶基因在藍藻細胞內編碼具有丙酮酸脫羧酶活性和乙醇脫氫酶活性的蛋白。本專利技術使用的宿主是藍藻，其可以是集胞藻(Synechocystis)、隱球藻屬 (Aphanocaps)、魚腥藻屬(Anobaena)、念珠藻屬(Nostoc)、顫藻屬(Oscillatoria)、聚球藻屬(Synechococcus)、球藻屬(Gloeocapsa)、阿格藻屬(Agmmenellumm)、雙歧藻屬 (Scytonema)或鞭枝藻屬(Mastigocladus)。本專利技術的藍藻優選為集胞藻(Synechocystis sp.)。在本專利技術的一個方面，采用的宿主是集胞藻PCC6803。本專利技術的基因工程藍藻含有整合到染色體上的編碼丙酮酸脫羧酶和乙醇脫氫酶的核酸。丙酮酸脫羧酶(pyruvate decarboxylase, PDC)廣泛存在于豆類植物、麻黃等植物、釀酒酵母屬(Saccharomyces species)、曲霉屬等真菌中，另外運動單胞菌(Zymomonas mobilis)、醋桿菌屬(Acetobacter species)中也都含有丙酮酸脫羧酶。不同來源的丙酮酸脫羧酶，其編碼序 列和活性有所不同。已經對各種來源的丙酮酸脫羧酶進行了測序和活性研究，發現不同來源的丙酮酸脫羧酶的序列有所區別，但也具有很多保守的區域和活性位點。其中，如Genebank報道的，運動單胞菌的丙酮酸脫羧酶具有如SEQ ID NO.1的氨基酸序列，其基因pdc具有如SEQ ID NO. 2的核酸序列。不同來源的丙酮酸脫羧酶的序列有所區別，但都具有對應于SEQ ID NO.1的氨基酸序列，其中存在保守序列和活性位點。乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogena se,ADH)大量存在于人和動物肝臟、植物及微生物細胞之中，是一種含鋅金屬酶，具有廣泛的底物特異性，其分子由兩個亞基組成，其中一個位于酶的活性中心，另一個起穩定四級結構的作用。乙醇脫氫酶夠以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(MD)為輔酶，催化伯醇和醛之間的可逆反應CH3CH20H+NAD+ — CH3CH0+NADH+H+。 在人和哺乳動物體內，乙醇脫氫酶與乙醛脫氫酶(ALDH)構成了乙醇脫氫酶系，參與體內乙醇代謝。酵母和細菌(乳酸菌，以及某些條件下的大腸桿菌除外)不將葡萄糖發酵為乳酸， 而是將葡萄糖發酵為乙醇和二氧化碳?？偡磻綖镚lucose+2ADP+2Pi —2ethanol+2C02+2 ATP+2H20。在酵母和許多細菌中，乙醇脫氫酶在發酵起著重要作用從糖酵解產生的丙酮酸轉化為乙醛和二氧化碳，隨后乙醛在ADHI的作用下轉化為乙醇。后一步的目的是重新產生 NAD+，于是糖酵解的能量生成得以繼續。不同來源的乙醇脫氫酶，其編碼序列和活性有所不同。已經對各種來源的乙醇脫氫酶進行了測序和活性研究，發現不同來源的乙醇脫氫酶的序列和活性有所區別。其中，如Genebank報道的，聚球藻的其中一種乙醇脫氫酶ADH B具有如SEQ ID NO. 3的氨基酸序列，其基因adhB具有如SEQ ID NO. 4的核酸序列。不同來源的乙醇脫氫酶的序列有所區別，但可具有對應于SEQ ID NO. 3的氨基酸序列，其中存在保守序列和活性位點。根據生物學理論知識，生物的蛋白的氨基酸序列會發生變異，所述蛋白的變異通常是由編碼該蛋白的基因的突變造成基因的突變可以是自發?，F代基因工程技術令有目的的點突變變成可能。點突變法可經由設計好的寡核苷酸，在任何一個基因片段上對某個核酸或多個核酸進行設計好的突變，例如通過聚合酶鏈式反應(PCR)等方法向目的DNA片段(可以是基因組，也可以是質粒)中引入所需變化(通常是表征有利方向的變化)，包括堿基的添加、刪除、點突變等。定點突變能迅速、高效的提高DNA所表達的目的蛋白的性狀及表征，成為基因研究工作或產業開發中一種非常有用的手段。氨基酸蛋白質是生物體本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種利用光合作用生產乙醇的基因工程藍藻，其含有整合到染色體上的外源基因，所述外源基因為丙酮酸脫羧酶基因和乙醇脫氫酶基因，其中所述丙酮酸脫羧酶基因編碼的丙酮酸脫羧酶具有對應于SEQ?ID?NO.1的氨基酸序列，并且其中自N端第290位的蘇氨酸Thr具有突變，以及所述乙醇脫氫酶基因編碼的乙醇脫氫酶具有對應于SEQ?ID?NO.3的氨基酸序列，其中所述第290位的蘇氨酸Thr突變為酪氨酸(Tyr)、半胱氨酸(Cys)、甘氨酸(Gly)、絲氨酸(Ser)、天冬酰胺(Asn)或谷氨酰胺(Gln)，優選為酪氨酸(Tyr)。

【技術特征摘要】
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【專利技術屬性】
技術研發人員：范文俊，鄭曉光，
申請(專利權)人：浙江齊成碳能科技有限公司，
類型：發明
國別省市：