本發明專利技術公開了一種豬II型圓環病毒ORF2蛋白的制備方法，將編碼PCV2核衣殼蛋白的Cap基因連接到pET-28a(+)質粒上構建成表達質粒pET-28-Cap，轉化BL21(DE3)感受態細胞，得到基因工程菌種pET-28-Cap/BL21。通過誘導表達及檢測表明該重組蛋白具有良好的反應原性。可進一步用來作為診斷抗原或制備亞單位疫苗。產物在大腸桿菌中以可溶性形式表達，表達量大且避免了蛋白變性再復性的繁瑣過程，降低了蛋白的損耗和生產成本。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種豬II型圓環病毒0RF2蛋白的制備方法。
技術介紹
豬II型圓環病毒(PCV2)是近年來新發現的動物病毒之一，屬于圓環病毒科，是一種二十面體對稱、無囊膜、單股環狀DNA病毒，病毒粒子直徑為17nm，是目前發現的最小的動物病毒。該病最早于1991年在加拿大西部發現，根據致病性的不同，被分為PCV-1和 PCV-2。其中PCV-2對豬有較強的感染性，可經口腔、呼吸道途徑感染不同年齡的豬，引起斷奶仔豬多系統衰竭綜合征(PMWS)等。感染豬出現進行性消瘦、行動遲緩、呼吸困難、黃疸、 皮膚蒼白，甚至死亡，病原學及血清學調查表明，該病在許多國家都廣泛存在，給世界養豬業造成了很大的損失。PCV-2基因組含ORFl和0RF2，ORFl編碼Rep蛋白，參與病毒復制，0RF2編碼233個氨基酸，是病毒的核衣殼蛋白(Cap)，具有良好的免疫原性，是構建重組疫苗和臨床檢測的首選抗原。大腸桿菌表達系統不僅具有遺傳背景清楚，培養操作簡單、轉導效率高、生長繁殖快、 成本低廉、可以快速大規模地生產目的蛋白等優點，而且其表達外源基因產物的水平遠高于其它基因表達系統，因此大腸桿菌是目前應用最廣泛的蛋白 質表達系統。另外，誘導劑乳糖是一種二糖，沒有毒性，價格低廉，其本身作為一種碳源，可以被菌體代謝利用，乳糖所具備的無毒和價廉的優點，使得其在重組蛋白的大規模發酵生產中，仍具有優于IPTG的潛在價值和優勢。豬II型圓環病毒(PCV2)細胞培養滅活疫苗產量低且國內缺乏對PCV2疫苗統一的生產檢驗方法及標準，這些問題已成為限制該類產品開發和應用的瓶頸；新型的疫苗如DNA疫苗，免疫效率還有待證實，而國外已有亞單位疫苗上市，能顯著降低病毒血癥，但價格昂貴。豬II型圓環病毒0RF2蛋白亞單位疫苗中已有關于使用酵母和桿狀病毒表達0RF2蛋白的報道，但酵母表達系統繁瑣，可能存在蛋白切割的問題，而桿狀病毒則存在表達成本高，蛋白純化困難等缺點。
技術實現思路
本專利技術的主要目的在于提供一種降低蛋白的損耗和生產成本的豬II型圓環病毒 0RF2蛋白的制備方法。本專利技術采用如下技術方案包括以下步驟1.序列合成通過序列比對，在保證編碼的氨基酸相同的前提下改變核苷酸序列，把序列中的稀有密碼子替換成大腸桿菌偏愛密碼子，并在序列兩端分別加上EcoR I和Not I限制性酶切位點，合成cap基因，連接到PES載體上，按照設定的限制性內切酶進行酶切，將目的片段克隆至pMD18-T質粒載體上，轉化感受態DH5a細胞，挑取陽性菌落，OMEGA試劑盒小量提取質粒，酶切鑒定陽性質粒；2.原核表達載體的構建與鑒定將質粒pES-Cap經EcoR I和Not I雙酶切，回收702bp的目的片段，與同樣經EcoR I 和Not I雙酶切的線性表達載體pET-28a+連接，連接體系目的片段5uL，pET_28a+載體 3uL，T4 DNA Ligase luL，10*buffer luL，4°C連接過夜；取 ΙΟμ 連接產物與 ΙΟΟμ BL21 感受態細胞混合，冰浴30min，42°C熱激90s后迅速置冰浴中靜置2min，加入800μ 無抗生素的LB培養基，370C 150 rpm搖床培養45min后，5000rpm離心5min,棄上清，留200uL將菌體吹勻后涂布含kana，100 μ g/mL的LB平板，37°C溫箱倒置培養12_16h ;次日挑取白色單菌落，用含kana的LB培養基小量擴增培養；0MEGA試劑盒小量提取質粒；分別經PCR鑒定和EcoR ,Not I雙酶切鑒定，將鑒定陽性的重組質粒命名為pET-28-Cap并進行序列測定分析；3.重組菌的誘導表達將鑒定為陽性的BL21菌液按1:100的比例轉接到含kana的LB液體培養基中，37°C 振蕩培養至對數生長期時，0D_值為O. 6，加入不同終濃度的乳糖分別誘導2h、3h、4h、5h、 6h，同時設未誘導菌液對照和pET-28a/BL21誘導對照；取ImL菌液，13000rpm離心Imin 后，棄上清，加入 50uL PBS 和 50uL 2*SDS_PAGE Loading Buffer 重懸，沸水煮 5 min，進行12%SDS-PAGE，結果顯示，pET-28-cap在30kDa處有一條很濃的蛋白條帶，與預期目的條帶大小相符；而未經誘導的重組菌則無此條帶，空載體質粒pET-28a+轉化菌經誘導后在約 7kDa處出現組氨酸標簽蛋白條帶，說明蛋白已經得到了表達；4.重組菌的可溶性表達及蛋白純化通過對誘導溫度，誘導時間，誘導劑濃度等誘導條件的摸索，重組菌在37°C，10g/L乳糖濃度等誘導條件下誘導表達6h ，蛋白的可溶性表達量最大；凍融菌體并進行超聲破碎 30min，設置為間隔I秒，超聲3秒，離心后收集上清和沉淀；上清和沉淀中的蛋白樣品進行 12%SDS-PAGE電泳；對可溶性的重組蛋白進行His-蛋白質鎳親和層析。本專利技術豬II型圓環病毒0RF2蛋白的制備方法的有益效果是利用大腸桿菌表達系統， 不斷摸索誘導條件，實現了蛋白的可溶性表達，避免了蛋白變性、復性等的繁瑣過程，降低了生產成本,適宜于規模化發酵生產。附圖說明圖1為pET-28-cap重組菌在大腸桿菌中的蛋白表達；圖 2 western blot 鑒定圖。在圖1中，1、2、4、5為誘導的pET-28-cap重組菌；M為低分子量蛋白marker ;3為未誘導的pET-28-cap重組菌；6為空載體pET_28a(+)對照；在圖2中，M為低分子量預染蛋白marker ;1為目的蛋白；2為未誘導菌體對照。具體實施方式請參閱圖1和圖2所示，本專利技術的一種豬II型圓環病毒0RF2蛋白的制備方法，包括以下步驟1.序列合成通過序列比對，在保證編碼的氨基酸相同的前提下改變核苷酸序列，把序列中的稀有密碼子替換成大腸桿菌偏愛密碼子，并在序列兩端分別加上EcoR I和Not I限制性酶切位點，合成cap基因，連接到PES載體上，按照設定的限制性內切酶進行酶切，將目的片段克隆至pMD18-T質粒載體上，轉化感受態DH5a細胞，挑取陽性菌落，OMEGA試劑盒小量提取質粒，酶切鑒定陽性質粒。2.原核表達載體的構建與鑒定 將質粒pES-Cap經EcoR I和Not I雙酶切，回收702bp的目的片段，與同樣經EcoR I 和Not I雙酶切的線性表達載體pET-28a(+)連接，連接體系目的片段5uL，pET_28a(+) 載體 3uL，T4 DNA Ligase luL，10*buffer luL，4°C連接過夜。取 ΙΟμ 連接產物與 ΙΟΟμ BL21 (DE3)感受態細胞混合，冰浴30min，42°C熱激90s后迅速置冰浴中靜置2min，加入 800μ 無抗生素的LB培養基，37°C 150 rpm搖床培養45min后，5000rpm離心5min，棄上清，留200uL將菌體吹勻后涂布含kana (100 μ g/mL)的LB平板，37°C溫箱倒置培養12_16h。 次日挑取白色單菌落，用含kana的LB培養基小量擴增培養。OMEGA試劑盒小量提取質粒。 分別經PCR鑒定和EcoR ,Not I雙酶切鑒定，將鑒定陽性的重組質粒命名為pET-28-Cap并進行序列測定分析。本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種豬II型圓環病毒ORF2蛋白的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：1.序列合成通過序列比對，在保證編碼的氨基酸相同的前提下改變核苷酸序列，把序列中的稀有密碼子替換成大腸桿菌偏愛密碼子，并在序列兩端分別加上EcoR?I和Not?I?限制性酶切位點，合成cap基因，連接到PES載體上，按照設定的限制性內切酶進行酶切，將目的片段克隆至pMD18?T質粒載體上，轉化感受態DH5a細胞，挑取陽性菌落，OMEGA試劑盒小量提取質粒，酶切鑒定陽性質粒；2．原核表達載體的構建與鑒定將質粒pES?Cap經EcoR?I和Not?I雙酶切，回收702bp的目的片段，與同樣經EcoR?I和Not?I雙酶切的線性表達載體pET?28a(+)連接，連接體系：目的片段5uL，pET?28a(+)?載體3uL，T4?DNA?Ligase?1uL，10*buffer?1uL，4℃連接過夜；取10μL連接產物與100μL?BL21感受態細胞混合，冰浴30min，42℃熱激90s后迅速置冰浴中靜置2min，加入800μL無抗生素的LB培養基，37℃?150?rpm搖床培養45min后，5000rpm離心5min，棄上清，留200uL將菌體吹勻后涂布含kana，100μg/mL的LB平板，37℃溫箱倒置培養12?16h；次日挑取白色單菌落，用含kana的LB培養基小量擴增培養；OMEGA試劑盒小量提取質粒；分別經PCR鑒定和EcoR??、Not?I雙酶切鑒定，將鑒定陽性的重組質粒命名為pET?28?Cap并進行序列測定分析；3.重組菌的誘導表達將鑒定為陽性的BL21菌液按1：100的比例轉接到含kana的LB液體培養基中，37℃振蕩培養至對數生長期時，OD600值為0.6，加入不同終濃度的乳糖分別誘導2h、3h、4h、5h、6h，同時設未誘導菌液對照和pET?28a/BL21誘導對照；取1mL菌液，13000rpm離心1min后，棄上清，加入50uL?PBS和50uL?2*SDS?PAGE?Loading?Buffer重懸，沸水煮5?min，進行12%SDS?PAGE，結果顯示，pET?28?cap在30kDa處有一條很濃的蛋白條帶，與預期目的條帶大小相符；而未經誘導的重組菌則無此條帶，空載體質粒pET?28a(+)轉化菌經誘導后在約7kDa處出現組氨酸標簽蛋白條帶，說明蛋白已經得到了表達；4.重組菌的可溶性表達及蛋白純化通過對誘導溫度，誘導時間，誘導劑濃度等誘導條件的摸索，重組菌在37℃，10g/L?乳糖濃度等誘導條件下誘導表達6h，蛋白的可溶性表達量最大；凍融菌體并進行超聲破碎30min，設置為間隔1秒，超聲3秒，離心后收集上清和沉淀；上清和沉淀中的蛋白樣品進行12%SDS?PAGE電泳；對可溶性的重組蛋白進行His?蛋白質鎳親和層析。...
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：李朝陽，李明義，石喬，
申請(專利權)人：山東信得科技股份有限公司，
類型：發明
國別省市：
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