本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種雞傳染性法氏囊病VP2基因，其氨基酸序列為SEQ?ID?NO:1。本發(fā)明專利技術(shù)篩選出的雞傳染性法氏囊病VP2基因用作基因工程亞單位疫苗。本發(fā)明專利技術(shù)篩選出的雞傳染性法氏囊病VP2基因制備的亞單位疫苗免疫21日齡SPF雞，21日后能產(chǎn)生堅強(qiáng)免疫力，使免疫雞抵抗雞傳染性法氏囊病病毒強(qiáng)毒的攻擊。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于禽類抗原篩選
，具體涉及一種雞傳染性法氏囊病VP2基因及其應(yīng)用。
技術(shù)介紹
雞傳染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease, IBD)又稱雞傳染性腔上囊病，是由傳染性法氏囊病毒引起的一種急性、接觸傳染性疾病。以法氏囊發(fā)炎、壞死、萎縮和法氏囊內(nèi)淋巴細(xì)胞嚴(yán)重受損為特征，能夠引起雞的免疫機(jī)能障礙，干擾各種疫苗的免疫效果。該病發(fā)病率高，是目前養(yǎng)禽業(yè)最重要的疾病之一。 接種疫苗是一種有效的預(yù)防傳染性法氏囊病的措施，目前普遍使用的弱毒苗和滅活苗雖然對IBD的預(yù)防起了相當(dāng)大的作用，但由于近年來雞傳染性法氏囊病毒(IBDV)變異株和超強(qiáng)毒株的出現(xiàn)，經(jīng)常導(dǎo)致免疫失敗，傳統(tǒng)的滅活疫苗和弱毒疫苗已經(jīng)面臨著嚴(yán)峻的考驗，基因工程亞單位疫苗的出現(xiàn)為雞傳染性法氏囊病預(yù)防提供了一條新的途徑。基因工程亞單位疫苗又稱重組亞單位疫苗或生物合成亞單位疫苗，是利用DNA重組技術(shù)，將編碼病原微生物保護(hù)性抗原的基因?qū)胧荏w菌(如大腸桿菌)或細(xì)胞，使其在受體中高效表達(dá)，分泌保護(hù)性抗原肽鏈。提取保護(hù)性抗原肽鏈，加入佐劑即制成基因工程亞單位疫苗。但制備基因工程亞單位疫苗的關(guān)鍵是篩選出新的，具有更好免疫原性的抗原基因。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是提供一種雞傳染性法氏囊病毒(IBDV)的主要宿主保護(hù)性抗原VP2基因，即一種具有了 IBD超強(qiáng)毒的VP2基因，并將該基因重組表達(dá)后制成亞單位疫苗，從而有效彌補(bǔ)現(xiàn)有雞傳染性法氏囊病疫苗對IBDV變異株免疫不高的缺陷。本專利技術(shù)篩選出的雞傳染性法氏囊病VP2基因，其氨基酸序列為SEQ ID NO:1。上述雞傳染性法氏囊病VP2基因的核苷酸序列為SEQ ID NO:2。本專利技術(shù)篩選出的雞傳染性法氏囊病VP2基因用作基因工程亞單位疫苗。本專利技術(shù)篩選出的雞傳染性法氏囊病VP2基因制備的亞單位疫苗免疫21日齡SPF雞，21日后能產(chǎn)生堅強(qiáng)免疫力，使免疫雞抵抗雞傳染性法氏囊病病毒強(qiáng)毒的攻擊。具體實施例方式IBDV的主要結(jié)構(gòu)蛋白VP2蛋白是最主要宿主保護(hù)性抗原，本專利技術(shù)是用PCR方法擴(kuò)增了 IBD超強(qiáng)毒的VP2基因，克隆到pET-28a載體上，轉(zhuǎn)化BL21 (DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后VP2蛋白獲得了表達(dá)，將表達(dá)菌體高壓勻漿破碎后離心取上清即為VP2蛋白溶液，加入礦物油佐劑制成油乳劑疫苗，可用于預(yù)防雞傳染性法氏囊病。下面結(jié)合具體的實施例對本專利技術(shù)的雞傳染性法氏囊病毒VP2基因進(jìn)行詳細(xì)的描述。一、VP2基因的篩選用Primer5. 0軟件設(shè)計了一對擴(kuò)增雞傳染性法氏囊病病毒VP2全基因引物，并在上游引物5'端加入保護(hù)性堿基及BamH I酶切位點，在下游引物的5'端加入保護(hù)性堿基和Xho I酶切位點，引物序列為Primer1:5' -GCG TCG ACA TGA CAA ACC TGC AAG ATC - 3'Primer 2 :5' -CCC TCG AGT TAT CCT TAT GGC CCG GAT T -3'取200 W用臨床分離的疑似IBDV的病料感染的雞胚接種尿囊膜懸液上清液，按RNAisoReagent說明書所述方法提取病毒RNA,按反轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為(50 m) 10 X PCR Buffer 5W，dNTP (IOmM each) IW，上、下游引物(IOmM)各 1耵，cDNA 3 W，25mM MgCl2 4 W，Taq酶(5U/>1 ) ll^l，ddH2034W ;PCR 反應(yīng)參數(shù)95°C 5min，95°C lmin，58°C 2min，72°C 2min，35 個循環(huán)，72 °CIOmin。得到一個1300bp左右的片段，切膠回收該片段，與pMD-18T載體連接。PCR回收片段 6W，T 載體 2W (稀釋 10 倍后)，T4 DNA 連接酶 1W，T4 buffer 2. 5W，水13. 5W，總 計25沿。16°C過夜連接，取20沿連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109，挑選10個白色菌落培養(yǎng)，提取質(zhì)粒鑒定正確的選取3個測序，結(jié)果3個質(zhì)粒的測序結(jié)果都一致，證明獲得的核苷酸片段在擴(kuò)增的過程中沒有產(chǎn)生錯誤，其核苷酸序列為SEQ ID N0:2，翻譯的氨基酸序列為 SEQ ID NO:1。將該核苷酸序列在NCBI上Blast比對，有十幾個堿基發(fā)生了點突變，導(dǎo)致翻譯的氨基酸序列也有幾個位點專利技術(shù)變化。表明該毒株為一新的流行毒株。這是由于VP2蛋白是主要宿主保護(hù)性抗原，經(jīng)常發(fā)生突變而導(dǎo)致抗原性發(fā)生差異。二、VP2重組蛋白的表達(dá)將鑒定正確的上述一個質(zhì)粒用BamH I和Xho I雙酶切回收基因片段，與用這兩個酶切的pET-28a載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109，提取質(zhì)粒鑒定正確后轉(zhuǎn)化感受體的BL21 (DE3)，挑取單菌落，轉(zhuǎn)接5mlLB小管培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)3 4小時至0D600為0. 6時，加入終濃度為0. 8mM的IPTG誘導(dǎo)4飛小時，SDS-PAGE電泳結(jié)果證實為分泌表達(dá)。將表達(dá)菌用10倍菌體濕重PBS重懸，高壓勻漿破碎細(xì)菌，離心取上清，做瓊脂免疫擴(kuò)散試驗，結(jié)果瓊擴(kuò)效價不低于1:64。三、VP2蛋白的純化用鎳柱純化，200mM的咪唑洗脫，洗脫液用PBS透析過夜。所得透析液即為純化的蛋白，可用于制苗。四、VP2亞單位疫苗的制備取注射用白油94份、司本-80 6份、硬脂酸鋁2份，混合后，加熱溶化，116°C滅菌30分鐘，作為制苗用油相；加入滅菌的吐溫-80 4份，然后加入上述制備的VP2重組蛋白發(fā)酵提取液96份，充分振搖，使吐溫-80完全溶解，作為制苗用水相；取油相3份放于膠體磨內(nèi)，開動電機(jī)慢速轉(zhuǎn)動攪拌，同時徐徐加入水相I份，加完后再以10000r/min攪拌2 5分鐘，在終止攪拌前加入I %硫柳汞溶液，使其最終濃度為0. 01 %。VP2亞單位疫苗的免疫效果將20只SPF雞隨機(jī)分為兩組，每組10只，其中一組在21日齡時以0. 3ml/只的劑量皮下注射VP2亞單位疫苗，免疫21日后連同不免疫對照組每只經(jīng)點眼途徑接種100BID雞傳染性法氏囊病強(qiáng)毒BC6-85株毒液，攻毒后每天觀察雞只的臨床表現(xiàn)及死亡情況，記錄發(fā)病和死亡雞數(shù)，剖檢觀察死亡雞法氏囊等病變，72 96小時撲殺存活雞，逐只剖解，觀察法氏囊等病理變化。結(jié)果不免疫對照組8只雞發(fā)病，而免疫組雞只無發(fā)病。上述結(jié)果證明 本專利技術(shù)制備的VP2亞單位疫苗具有很好的免疫原性。權(quán)利要求1.一種雞傳染性法氏囊病VP2基因，其氨基酸序列為SEQ ID NO:1。2.一種核苷酸，所述的核苷酸用于編碼權(quán)利要求1所述的雞傳染性法氏囊病VP2基因。3.如權(quán)利要求2所述的核苷酸，其特征在于所述的核苷酸的序列為SEQID N0:2。4.權(quán)利要求1所述的雞傳染性法氏囊病VP2基因在制備基因工程亞單位疫苗中的應(yīng)全文摘要本專利技術(shù)涉及一種雞傳染性法氏囊病VP2基因，其氨基酸序列為SEQ ID NO:1。本專利技術(shù)篩選出的雞傳染性法氏囊病VP2基因用作基因工程亞單位疫苗。本專利技術(shù)篩選出的雞傳染性法氏囊病VP2基因制備的亞單位疫苗免疫21日齡SPF雞，21日后能產(chǎn)生堅強(qiáng)免疫力，使免疫雞抵抗雞傳染性法氏囊病病毒強(qiáng)毒的攻擊。文檔編號A61P31/14GK102994520SQ20121050908公本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點】
一種雞傳染性法氏囊病VP2基因，其氨基酸序列為SEQ?ID?NO:1。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：王雷，凌紅麗，王睿智，張園園，
申請(專利權(quán))人：青島康地恩藥業(yè)股份有限公司，青島寶依特生物制藥有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
還沒有人留言評論。發(fā)表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。