本發明專利技術公開了鴨瘟病毒gE基因轉移載體pUC-ΔgE-EGFP，包含轉移載體pUC-ΔgE-EGFP的大腸桿菌種(Escherichia?coli)JM109于2012年2月24日保藏于位于中國武漢大學的中國典型培養物保藏中心，其保藏編號為CCTCC?M2012033；分類命名為大腸桿菌JM109/pUC-ΔgE-EGFP(Escherichia?coli?JM109/pUC-ΔgE-EGFP)。該轉移載體可通過與鴨瘟病毒同源重組，獲得EGFP標記基因的重組鴨瘟病毒，鴨瘟病毒gE缺失重組株DPV-ΔgE-EGFP，于2012年2月23日保藏于位于中國武漢大學的中國典型培養物保藏中心，其保藏編號為CCTCC?NO：V201210。該重組病毒將可以發展成為具有篩選標記的有效預防鴨瘟的新型疫苗。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及動物醫學領域中一種基因工程制品的制備方法，特別涉及鴨瘟病毒gE基因部分缺失的轉移載體構建及其應用。
技術介紹
鴨痕(duck plague,DP)是由皰疫病毒科中的鴨痕病毒(Duck plague virus,DPV)引起的常見于鴨、鵝、天鵝等雁形目水禽的一種高度致死性傳染病。目前，鴨瘟仍是危害水禽養殖業持續穩定發展的重要因素，加強鴨瘟的研究對水禽養殖業的防制尤為重要。用于預防鴨瘟的疫苗主要有滅活苗和弱毒苗兩大類，一般認為弱毒苗免疫效力較滅活苗好，弱毒苗雖然只使鴨體產生低水平中和抗體，當受強毒攻擊時可使鴨體產生明顯的血清記憶反應。基因缺失疫苗毒株穩定，不易返祖，免疫原性好、安全性高。gE基因是非常重要的毒力基因，它的缺失使病毒的毒力大大降低，但是病毒仍可以復制，因此在皰疹病毒基因工程疫苗中gE基因缺失疫苗的研究十分關鍵。另一方面，重組病毒活載體疫苗兼有常規活疫苗和滅活疫苗的優點，是當前新型疫苗研制與開發的主要方向。皰疹病毒是用于活載體疫苗制備的理想病毒載體之一，作為皰疹病毒成員的鴨瘟病毒，基因組較大，約160kb左右，可容納多個外源基因的插入。以gE基因作為一個插入位點，來表達外源基因蛋白，由于gE基因的缺失、突變，從而使該鴨瘟病毒的野毒株毒力減弱，不再引起臨床疾病，但仍能感染宿主并誘發保護性免疫力，而且和外源基因蛋白的共表達，可產生多聯疫苗。
技術實現思路
有鑒于此，本專利技術的目的在于提供一種鴨瘟病毒轉移載體及其構建方法，該轉移載體可通過與鴨瘟病毒同源重組，獲得重組鴨瘟病毒，為鴨瘟病毒gE基因缺失疫苗及其gE基因功能研究打下基礎。一種鴨瘟病毒gE基因轉移載體pUC- Δ gE-EGFP,包含轉移載體pUC_ Δ gE-EGFP的大腸桿菌種(Escherichia coli) JM109于2012年2月24日保藏于位于中國武漢大學的中國典型培養物保藏中心，其保藏編號為CCTCC NO :M2012033 ;分類命名為大腸桿菌JM 109/pUC-ΔgE-EGFP(Escherichia coli JM109/pUC-ΔgE-EGFP)。所述的轉移載體pUC- Δ gE-EGFP的制備方法，包括以下步驟I)以鴨瘟病毒CHv株為材料，利用PCR擴增部分gE基因及其左側翼(L) 1073bp片段和部分gE基因及其右側翼(R) 1130bp片段，克隆進載體pMD18-T，構建質粒pMD_L和PMD-R ；2)先將pMD-L用Hind III和BamH I酶切，回收1073bp片段，克隆進已用相應限制性內切酶酶切的PUC18載體，然后再將pMD-R中的部分gE基因及其右側翼(R) 1130bp片段以BamH I和EcoR I插入到已含有部分gE基因及其左側翼(L)的pUC_L載體中，獲得載體 pUC-ΔgE ；3)用ApaL I和Mlu I酶切質粒pEGFP_Cl，回收包含CMV立即早期啟動子、EGFP基因、轉錄終止信號SV40polyA以及一個多克隆位點基因共2016bp片段的EGFP表達盒，然后對其進行補平；4)先將載體pUC-AgE，用BamH I酶切后，進行補平，再將其與3)中獲得補平后的EGFP表達盒連接，從而獲得轉移載體pUC- Δ gE-EGFP ；上述擴增PCR擴增部分gE基因及其左側翼(L) 1073bp片段的上、下游引物分別是上游引物5'-AAGCTTCCTGAAAGATGTTCTAAG-3'下游引物5'-GGATCCTTGATGATAGTCTGCTATAC-3' 上述擴增PCR擴增部分gE基因及其右側翼(R)1130bp片段的上、下游引物分別是上游引物5'-GGATCCGITTGTAGTCGGTCTCGG-3'下游引物5'-GAATTCCGTATTAACCTTTTGTAGCT-3'。鴨瘟病毒gE缺失重組株DPV-Λ gE-EGFP，于2012年2月23日保藏于位于中國武漢大學的中國典型培養物保藏中心，其保藏編號為CCTCC NO :V201210。所述鴨瘟病毒gE缺失重組株DPV- Δ gE-EGFP的制備方法，由以下步驟完成I)鴨瘟病毒CHv株感染鴨胚成纖維細胞；2)轉移載體pUC- Δ gE-EGFP質粒轉染；3)收獲出現熒光斑的細胞；4)結合無限稀釋法，通過空斑純化獲得重組鴨瘟病毒。實驗結果表明重組病毒和弱毒疫苗均能提供較好的保護，并且重組病毒表現出更優的免疫效果，可以進一步發展成為有效預防鴨瘟病的新型疫苗。附圖說明圖1鴨瘟病毒gE基因的跨膜區預測。結果表明gE蛋白有跨膜區域，是典型的I型膜蛋白。gE蛋白由396個氨基酸的胞外區、23個氨基酸的跨膜區和71個氨基酸的胞質區所組成。圖2轉移載體左右臂PCR擴增。M為DL2000，L指左臂片段，大小為1073bp ；R指右臂片段，大小為1130bp。圖3包含CMV立即早期啟動子、EGFP基因、轉錄終止信號SV40polyA以及一個多克隆位點基因共2016bp片段的EGFP表達盒片段。M為DL2000，G代表EGFP表達盒。圖4轉移載體pUC- Δ gE-EGFP結構示意圖。圖5感染重組病毒DPV- Δ gE-EGFP的鴨胚成纖維細胞呈現均一綠色熒光。圖6常規PCR鑒定重組病毒DPV- Δ gE-EGFP的結果。M為DL15000，I為DPV-CHv親本株擴增片段約1800bp，2為重組病毒DPV- Δ gE-EGFP的擴增片段約2700bp。圖7A、B、C分別為鴨瘟病毒CHv親本株在可見光顯微鏡下、熒光顯微鏡下及合成圖片，D、E、F分別為重組病毒DPV- Δ gE-EGFP在可見光顯微鏡下、熒光顯微鏡下及合成圖片。具體實施例方式以下結合具體實施例，對本專利技術進行詳細說明。包含轉移載體pUC-Λ gE-EGFP 的大腸桿菌種(Escherichia coli) JM109 于 2012年2月24日保藏于位于中國武漢大學的中國典型培養物保藏中心，其保藏編號為CCTCCNO :M2012033 ;分類命名為大腸桿菌 JM109/pUC-Λ gE-EGFP (Escherichia coli JM 109/pUC-ΔgE-EGFP)。鴨瘟病毒gE缺失重組株(DPV- Δ gE-EGFP)已于2012年2月23日保藏于位于中國武漢大學的中國典型培養物保藏中心，其保藏編號為CCTCC NO :V201210。 I病毒毒株和細胞鴨瘟病毒強毒DPV CHv株由四川農業大學禽病防治研究中心分離、鑒定保存，該病毒株已與2012年2月23日保存在位于中國武漢大學的中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為=CCTCC NO :V201209，分類命名為鴨瘟病毒CH virulent株(DPV CHv);鴨瘟病毒弱毒疫苗株購自成都天邦生物制品有限公司產品，獸藥生產許可證證號(2006)獸藥生產證字07022號；批準文號獸醫生字(2006)070222023);鴨胚成纖維細胞(DEF)用含10%小牛血清的MEM培養基于37°C培養。2質粒和菌株大腸桿菌JM109、質粒pUC18等購自寶生物工程(大連)有限公司；質粒pEGFP_Cl購自 Clontech03分子生物學試劑Lipofectamine 2000、MEM 和小牛血清購自 Invit本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種鴨瘟病毒gE基因轉移載體pUC?ΔgE?EGFP，包含轉移載體pUC?ΔgE?EGFP的大腸桿菌種(Escherichia?coli)JM109于2012年2月24日保藏于位于中國武漢大學的中國典型培養物保藏中心，其保藏編號為CCTCC?NO：M2012033；分類命名為大腸桿菌JM109/pUC?ΔgE?EGFP(Escherichia?coli?JM109/pUC?ΔgE?EGFP)。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：程安春，孫昆峰，常華，汪銘書，陳孝躍，
申請(專利權)人：四川農業大學，
類型：發明
國別省市：
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