本發(fā)明專利技術(shù)涉及大巖桐植株再生方法，尤其涉及農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因培養(yǎng)大巖桐植株的方法。農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因培養(yǎng)大巖桐植株的方法，該方法采用大巖桐幼嫩葉片作為外植體，外植體預(yù)培后與去除培養(yǎng)物中殘存的抗生素和細(xì)菌代謝物的農(nóng)桿菌菌株EHA105菌液共培，脫菌，再經(jīng)過(guò)抗性篩選后，直接分化獲得轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明專利技術(shù)由于采用了上述的技術(shù)方案，借助農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，可以快速高效轉(zhuǎn)化大巖桐，獲得轉(zhuǎn)化植株首次成功獲得大巖桐轉(zhuǎn)基因植株，取得了較好的成果。?
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及大巖桐植株再生方法，尤其涉及。
技術(shù)介紹
花卉作為鮮活觀賞商品，在圣誕節(jié)、元旦、春節(jié)等重大節(jié)日之前需求量大，其價(jià)格在需求高峰、一般、停滯等不同時(shí)期相差高達(dá)7、8倍，常常形成供給高潮與需求高峰期的錯(cuò)位，導(dǎo)致很大的生產(chǎn)和流通風(fēng)險(xiǎn)。因此，運(yùn)用現(xiàn)代基因工程技術(shù)培育有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的目標(biāo)花期花卉品種，不僅有利于保護(hù)花農(nóng)的經(jīng)濟(jì)利益，更有利于提升我國(guó)花卉產(chǎn)業(yè)的高科技含量，躋身于世界花卉生產(chǎn)強(qiáng)國(guó)的行列。大巖桐(Sinningia speciosa)原產(chǎn)巴西，為苦苣苔科多年生球根花丼，是一種極好的春夏季節(jié)室內(nèi)盆花，世界各地廣泛栽培。大巖桐外植體極易分化，在附加2. O mg/L 6-BA和O. 2 mg/L NAA的MS培養(yǎng)基上可不經(jīng)愈傷組織而在外植體邊緣直接分化苗，生長(zhǎng)也比較快速。如中國(guó)專利技術(shù)專利(申請(qǐng)?zhí)?00410061427. 9申請(qǐng)日2004-12_24)，公開(kāi)了一種大巖桐栽培方法，以組織培養(yǎng)的無(wú)根苗為材料，其步驟是，首先將大巖桐嫩梢切下；其次是將新梢插入基質(zhì)中；第3是澆灌營(yíng)養(yǎng)液；第4是將生根苗定植在相同的基質(zhì)中。但是國(guó)內(nèi)外對(duì)大巖桐的轉(zhuǎn)基因研究一直未見(jiàn)報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
為了解決上述的技術(shù)問(wèn)題，本專利技術(shù)的目的是提供一種，該方法可以快速高效轉(zhuǎn)化大巖桐，獲得轉(zhuǎn)化植株。為了實(shí)現(xiàn)上述的目的，本專利技術(shù)采用了以下的技術(shù)方案 ，該方法采用大巖桐幼嫩葉片作為外植體， 外植體預(yù)培后與去除培養(yǎng)物中殘存的抗生素和細(xì)菌代謝物的農(nóng)桿菌菌株EHA105菌液共培，脫菌，再經(jīng)過(guò)抗性篩選后，直接分化獲得轉(zhuǎn)基因植株。作為優(yōu)選，上述的農(nóng)桿菌菌株EHA105菌液的0D_為O. 2^0. 4，共培的時(shí)間為2 4天。作為優(yōu)選，上述的共培的方法如下取出預(yù)培養(yǎng)的葉片于無(wú)菌的小燒杯中，加入制備好的菌液中浸3 8min，搖晃數(shù)次；取出葉片，在無(wú)菌濾紙上吸干多余的菌液，葉背朝上置于基本MS固體培養(yǎng)基上，25°C，暗培養(yǎng)2 4d。作為優(yōu)選，上述的農(nóng)桿菌菌株EHA105菌液培養(yǎng)采用含有卡那霉素和利福平LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)。作為最優(yōu)選，上述的農(nóng)桿菌菌株EHA105菌液的制備方法如下I)從-70°C冰箱取出含有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌株EHA105，在含有抗生素Kan 100 mg/ L, Rif 80 mg/L的LB固體培養(yǎng)基上劃線活化，直至培養(yǎng)基上長(zhǎng)出農(nóng)桿菌單菌落；2)取5 IOmlLB液體培養(yǎng)基，加入抗生素-卡那霉素和利福平，使其終濃度為 Kan 100mg/L, Rif 80mg/L ;從新鮮平板中挑取單菌落加入其中，搖勻，于28°C，180 r/min過(guò)夜培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，OD600約為O. 8 1. O ;3)吸取上述菌液Iml于1.5ml離心管中，4°C,4000rpm離心2min,去上清，再用30ml 1/2 MS懸浮農(nóng)桿菌，再搖約l_2h，至菌液略顯混濁，OD600為O. 2^0. 4即可，備用。作為優(yōu)選，上述的脫菌采用特美汀無(wú)菌溶液水洗。由于現(xiàn)有的羧芐青霉素和頭孢霉素連續(xù)使用后，抗性愈傷組織分化頻率較低，因此在本專利技術(shù)中選用特美汀(160 mg/L)除菌，這樣既能取得除菌效果又不影響抗性組織的分化能力。作為優(yōu)選，上述的抗性篩選采用的標(biāo)記基因是hpt，采用潮霉素作為選擇壓力。在大巖桐的轉(zhuǎn)化中，現(xiàn)有的卡那霉素篩選會(huì)干擾綠色植株的再生，而絕大多數(shù)植物對(duì)潮霉素比對(duì)卡那霉素敏感，潮霉素用于植物轉(zhuǎn)化比卡那霉素的效果好。故我們都是選用潮霉素作為抗性篩選標(biāo)記。作為優(yōu)選，上述的潮霉素的濃度為20mg/L。作為優(yōu)選，上述的抗性篩選的抗性選擇培養(yǎng)基為MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.3 mg/ L+hgy 20mg/L+Tm 160 mg/L ;進(jìn)行兩輪選擇培養(yǎng)，每輪持續(xù)12 15d。作為優(yōu)選，上述的外植體預(yù)培取大巖桐無(wú)菌苗的中、上部的葉片，沿葉緣剪一圈， 接到含80 120 uM乙酰丁香酮的基本MS固體培養(yǎng)基上，25°C，暗培養(yǎng)2(T30h。本專利技術(shù)由于采用了上述的技術(shù)方案，借助農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，可以快速高效轉(zhuǎn)化大巖桐，獲得轉(zhuǎn)化植株首次成功獲得大巖桐轉(zhuǎn)基因植株，取得了較好的成果。附圖說(shuō)明圖1轉(zhuǎn)基因大巖桐的組培過(guò)程。圖2轉(zhuǎn)基因大巖桐的組培誘導(dǎo)分化以及生根。圖3大巖桐轉(zhuǎn)化植株的再生。圖4不同濃度潮霉素篩選壓下培養(yǎng)的大巖桐葉片。具體實(shí)施方式實(shí)施例1:農(nóng)桿菌的培養(yǎng)(1)從_70°C冰箱取出含有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌株EHA105，在含有抗生素(Kan100 mg/L, Rif 80 mg/L)的LB固體培養(yǎng)基上劃線活化，直至培養(yǎng)基上長(zhǎng)出農(nóng)桿菌單菌落；(2)取5 IOmlLB液體培養(yǎng)基，加入抗生素——卡那霉素和利福平，使其終濃度為Kan 100mg/L, Rif 80mg/L。從新鮮平板中挑取單菌落加入其中，搖勻，于28°C， 180 r/min過(guò)夜培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，OD600約為O. 8 1. O ;(3)吸取上述菌液Iml于1.5ml離心管中(Iml X 2), 4°C, 4000rpm離心2min,去上清。 再用30ml 1/2 MS懸浮農(nóng)桿菌(事先加入2ml 1/2 MS，用移液槍吸打均勻)，再搖約l_2h， 至菌液略顯混濁，0D600約為O. 3即可，備用。實(shí)施例2 :外植體的處理取大巖桐無(wú)菌苗的中、上部的葉片，沿葉緣剪一圈，接到含100 uM乙酰丁香酮(As)的基本MS固體培養(yǎng)基上，25°C，暗培養(yǎng)Id。實(shí)施例3 :轉(zhuǎn)化(1)取出預(yù)培養(yǎng)的葉片于無(wú)菌的小燒杯中，加入制備好的菌液中浸5min左右，搖晃數(shù)次；(2)取出葉片，在無(wú)菌濾紙上吸干多余的菌液，葉背朝上置于基本MS固體培養(yǎng)基上 ， 25°C，暗培養(yǎng)3 do實(shí)施例4 :脫菌與篩選培養(yǎng)(1)暗培養(yǎng)3d后，從培養(yǎng)基中收集葉片到滅菌的小燒杯中，經(jīng)如下過(guò)程洗滌無(wú)菌水漂洗3次一加入50ml含160mg/L特美汀(Tm)的無(wú)菌水洗2次一無(wú)菌濾紙吸干；(2)然后轉(zhuǎn)入抗性選擇培養(yǎng)基①上，進(jìn)行兩輪選擇培養(yǎng)，每輪持續(xù)2周；潮霉素(hgy)選擇培養(yǎng)基①M(fèi)S+6-BA 2 mg/L+NAA O. 3 mg/L+hgy 20mg/L+Tm 160 mg/L ；(3)將培養(yǎng)基①上再生的潮霉素抗性愈傷轉(zhuǎn)置生芽培養(yǎng)基②上；生芽培養(yǎng)基②MS+KT 2. 5 mg/L+NAA1. 9 mg/L+ GA31. O mg/L ；(4)將在生芽培養(yǎng)基②上長(zhǎng)至2 3cm的植株移植到增殖培養(yǎng)基③上繼續(xù)培養(yǎng)； 增殖培養(yǎng)基③MS+KT 2. O mg/L+NAA O. 2 mg/L+ GA31. O mg/L ；(5)將增殖培養(yǎng)基③上長(zhǎng)至2 3cm的植株移入生根培養(yǎng)基④上，做生根培養(yǎng)； 生根培養(yǎng)基④1/2 MS+NAA O. 2 mg/L+蔗糖2%。實(shí)施例5 :轉(zhuǎn)化植株的PCR鑒定1、選取轉(zhuǎn)化植株，用CTAB-free法微量提取基因組DNA，做PCR模板，進(jìn)行鑒定(O取少量幼葉，于液氮浴中用研缽磨成粉末，將粉末移入1. 5ml離心管，加入O. 6ml CTAB-free 緩沖液(200mmol/L Tris-HCl, 50mmol/L EDTA, 250mmol/L NaCl, 1%巰基乙醇)， 震蕩混勻后置于冰上放置lOmin。(2)4°C,8000r/min離心 5min,小心棄去上清,加入O. 3ml 預(yù)熱至 65°C的 3XCTAB 緩沖液(3% CTAB, IOO本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因培養(yǎng)大巖桐植株的方法，其特征在于：該方法采用大巖桐幼嫩葉片作為外植體，外植體預(yù)培后與去除培養(yǎng)物中殘存的抗生素和細(xì)菌代謝物的農(nóng)桿菌菌株EHA105菌液共培，脫菌，再經(jīng)過(guò)抗性篩選后，直接分化獲得轉(zhuǎn)基因植株。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：邊紅武，韓凝，朱睦元，李曉燕，張明哲，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：浙江大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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