本發明專利技術公開了一種淡紫醌霉素及其甲酯的制備方法。以鏈黑菌素產生菌-柔毛鏈霉菌Streptomyces.flocculus?CGMCC4.1223作為出發菌株，對該鏈黑菌素生物合成基因簇中的雙氧化酶基因stnBl實行選擇性敲除，獲得相應的stnBl基因失活突變株ΔstnBl；對突變株發酵產物粗提物采用反相硅膠、凝膠等柱層析和半制備HPLC等色譜分析技術，制得淡紫醌霉素及其甲酯。本發明專利技術建立了利用鏈黑菌素產生菌通過基因工程手段制備淡紫醌霉素的方法，提高了淡紫醌霉素和淡紫醌霉素甲酯的產量，分別達到每5升培養基可以獲得約1mg淡紫醌霉素和20mg淡紫醌霉素甲酯，并且經過菌種優化和發酵優化還有進一步提升的空間。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及抗腫瘤試劑制備領域，尤其涉及一種抗腫瘤試劑淡紫醌霉素Iavendamycin及其甲酯的生產工程菌株構建方法及它們的制備方法。
技術介紹
鏈黑菌素是一個由絨毛鏈霉菌(Streptomyces flocculus)產生的具有獨特喹啉環結構的抗腫瘤抗生素。其抗腫瘤活性良好，是一種廣譜抗腫瘤抗生素，對腦癌、頸癌、肺癌、卵巢癌、宮頸癌，特別是對白血病、淋巴瘤和黑素瘤具有很好的療效。鏈黑菌素的藥理作用是可選擇性地抑DNA合成，主要作用于S期，一個分子的鏈黑菌素可與2000個分子的脫氧核苷酸穩定地結合，并能使瘤細胞染色體斷裂，使已形成的DNA降解.由于具有較大的骨 髓毒性，因此很少單獨用藥用于臨床。鏈黑菌素含有四個環，其中三個環幾乎處于同一個平面，而第四個環與這個平面幾乎呈垂直狀態。淡紫醌霉素(Iavendamycin)是從鏈霉菌(S.1avendulea strain C22030)分離鑒定的氨基醌類化合物，具有與鏈黑菌素相類似的結構，但是其化學結構含有五個環，這五個環幾乎處于同一平面。淡紫醌霉素具有與鏈黑菌素相近的抗腫瘤活性和抗腫瘤譜，但是比鏈黑菌素低得多的毒性。自1981年淡紫醌霉素被報道以來，僅僅只有一例關于其產生菌的報道，目前該產生菌被國外公司保存，且產量低，文獻報道在8升發酵培養基中僅獲得O. 3mg淡紫醌霉素。而淡紫醌霉素甲酯則是淡紫醌霉素利用化學合成手段通過與甲醇發生酯化反應獲得的抗生素，目前并沒有天然微生物產生淡紫醌霉素甲酯的報道。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供利用鏈黑菌素產生菌通過生物技術操作制備淡紫醌霉素Iavendamycin及其甲酯的方法。鏈黑菌素產生菌Streptomyces flocculusCGMCC4. 1223的菌種來源于中國普通微生物菌種保藏管理中心，寄存來源是上海醫藥工業研究院。參考文獻中國科學院微生物研究所放線菌分類組，《鏈霉菌鑒定手冊》，1975，P202-205，科學出版社，北京。本專利技術通過對柔毛鏈霉菌Streptomyces flocculus CGMCC4. 1223進行針對鏈黑菌素生物合成基因簇中雙氧化酶的選擇性失活突變，得到相應的雙氧化酶失活突變菌株，從該突變株的發酵液中分離到淡紫醌霉素(Iavendamycin)及其甲酯化合物。本專利技術的目的是通過以下技術方案來實現的第一方面，本專利技術涉及一種淡紫醌霉素的制備方法，包括如下步驟A、以鏈黑菌素原始產生菌柔毛鏈霉菌Streptomyces flocculus CGMCC4. 1223為出發菌株，克隆得到鏈黑菌素生物合成基因簇；B、對所述鏈黑菌素生物合成基因簇中的雙氧化酶StnBl基因進行選擇性失活，獲得StnBl基因失活突變菌株Λ stnBl ；C、對所述突變菌株Λ stnBl進行發酵，將發酵液離心，離心后的濾液調整pH值至9 10，用不溶于水的中等極性有機溶劑A反復萃取，取水相濾液；D、調整所述水相濾液pH值至4 5，用所述不溶于水的中等極性有機溶劑反復萃取，收集中等極性有機溶劑相B，濃縮得到粗提物B，對所述粗提物B進行純化，即得。該淡紫醌霉素，其結構式如式(I )所示權利要求1.一種淡紫醌霉素的制備方法，其特征在于，包括如下步驟 A、以鏈黑菌素原始產生菌柔毛鏈霉菌Str印tomycesflocculus CGMCC4. 1223為出發菌株，克隆得到鏈黑菌素生物合成基因簇； B、對所述鏈黑菌素生物合成基因簇中的雙氧化酶StnBl基因進行選擇性失活，獲得StnBl基因失活突變菌株AstnBl ； C、對所述突變菌株AstnBl進行發酵，將發酵液離心，離心后的濾液調整pH值至9 10，用不溶于水的中等極性有機溶劑A反復萃取，取水相濾液； D、調整所述水相濾液pH值至4 5，用所述不溶于水的中等極性有機溶劑A反復萃取，收集中等極性有機溶劑相B，濃縮得到粗提物B，對所述粗提物B進行純化，即得。2.如權利要求1所述的淡紫醌霉素的制備方法，其特征在于，所述不溶于水的中等極性有機溶劑A為乙酸乙酯、乙醚、氯仿或正丁醇。3.如權利要求1所述的淡紫醌霉素的制備方法，其特征在于，步驟C中，所述不溶于水的中等極性有機溶劑A與離心后的濾液的體積比為1:3 2:1。4.如權利要求1所述的淡紫醌霉素的制備方法，其特征在于，步驟D中，所述不溶于水的中等極性有機溶劑A與水相濾液的體積比為1:3 2:1。5.如權利要求1所述的淡紫醌霉素的制備方法，其特征在于，步驟D中，所述純化為用PH值為11 13的堿性水溶液溶解所述粗提物B并離心，收集上清液；向上清液中滴加鹽酸至出現沉淀；離心棄去上清，沉淀凍干后加入乙腈溶解，經半制備性PHLC，以乙腈水溶液洗脫，接收對應的吸收峰，合并餾分后放置_20°C以下，待有沉淀析出后低溫離心，棄去上清，凍干沉淀，即得所述淡紫醌霉素。6.如權利要求5所述的淡紫醌霉素的制備方法，其特征在于，所述乙腈水溶液中乙腈的體積濃度為20% 100%。7.如權利要求5所述的淡紫醌霉素的制備方法，其特征在于，所述堿性水溶液為O.1 IM NaOH 溶液。8.一種淡紫醌霉素甲酯的制備方法，其特征在于，包括如下步驟 A、以鏈黑菌素原始產生菌柔毛鏈霉菌Str印tomycesflocculus CGMCC4. 1223為出發菌株，克隆得到鏈黑菌素生物合成基因簇； B、對所述鏈黑菌素生物合成基因簇中的雙氧化酶StnBl基因進行選擇性失活，獲得StnBl基因失活突變菌株AstnBl ； C、對所述突變菌株AstnBl進行發酵，將發酵液離心，離心后的濾液調整pH值至9 10，用不溶于水的中等極性有機溶劑A反復萃取，保留中等極性有機溶劑相A，濃縮得到粗提物A，對所述粗提物A進行純化，即得。9.如權利要求8所述的淡紫醌霉素甲酯的制備方法，其特征在于，步驟C中，所述不溶于水的中等極性有機溶劑A為乙酸乙酯、乙醚、氯仿或正丁醇。10.如權利要求8所述的淡紫醌霉素甲酯的制備方法，其特征在于，步驟C中，所述不溶于水的中等極性有機溶劑A與離心后的濾液的體積比為1:3 2:1。11.如權利要求8所述的淡紫醌霉素甲酯的制備方法，其特征在于，步驟C中，所述純化為將粗提物A用正相硅膠柱層析，以石油醚和中等極性有機溶劑B的混合物作為流動相洗脫，經HPLC分析檢測，合并含有淡紫醌霉素甲酯的餾分并濃縮，然后用反相硅膠進行柱層析，用甲醇水溶液洗脫，將所得到的餾分經HPLC檢測后合并餾分，濃縮干燥，得淡紫醌霉素甲酯。12.如權利要求11所述的淡紫醌霉素甲酯的制備方法，其特征在于，所述作為流動相的石油醚和中等極性有機溶劑B的體積比為1:3 10:1。13.如權利要求11或12所述的淡紫醌霉素甲酯的制備方法，其特征在于，所述中等極性有機溶劑B為乙酸乙酯、乙醚、二氯甲烷、氯仿、丙酮或異丙醇。14.如權利要求11所述的淡紫醌霉素甲酯的制備方法，其特征在于，所述甲醇水溶液中甲醇的體積濃度為60% 100%。全文摘要本專利技術公開了一種。以鏈黑菌素產生菌-柔毛鏈霉菌Streptomyces.flocculus CGMCC4.1223作為出發菌株，對該鏈黑菌素生物合成基因簇中的雙氧化酶基因stnBl實行選擇性敲除，獲得相應的stnBl基因失活突變株ΔstnBl；本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種淡紫醌霉素的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：A、以鏈黑菌素原始產生菌柔毛鏈霉菌Streptomyces?flocculus?CGMCC4.1223為出發菌株，克隆得到鏈黑菌素生物合成基因簇；B、對所述鏈黑菌素生物合成基因簇中的雙氧化酶stnBl基因進行選擇性失活，獲得stnBl基因失活突變菌株ΔstnBl；C、對所述突變菌株ΔstnBl進行發酵，將發酵液離心，離心后的濾液調整pH值至9～10，用不溶于水的中等極性有機溶劑A反復萃取，取水相濾液；D、調整所述水相濾液pH值至4～5，用所述不溶于水的中等極性有機溶劑A反復萃取，收集中等極性有機溶劑相B，濃縮得到粗提物B，對所述粗提物B進行純化，即得。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：林雙君，鄧子新，徐飛，
申請(專利權)人：上海交通大學，
類型：發明
國別省市：
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