本發明專利技術設計酶活檢測領域，具體地涉及飼用果膠酶DNS檢測法。根據本發明專利技術的飼用果膠酶DNS檢測法，其酶活定義為：1g酶粉或1mL酶液在pH3.5、37℃下，每分鐘從濃度為2.25mg/mL的底物（Sigma?P9135）溶液中分解釋放1μmol還原物質（表述為半乳糖醛酸）所需要的酶量為一個酶活單位U。本發明專利技術的檢測果膠酶活性的DNS檢測法確定了反應體系：包括反應溫度、反應pH值、底物濃度、酶液與底物比例、反應總體系等各種參數；確保該方法操作簡便，且重復性好。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術設計酶活檢測領域，具體地涉及飼用果膠酶DNS檢測法。
技術介紹
果膠酶是指能分解果膠物質的多種酶的總稱，它在破解植物細胞壁、促進內源酶分泌及消除抗營養因子方面發揮了不可替代的作用，在飼料工業中越來越受到重視。但果膠酶是包含多種組分的復合酶，按作用方式分類可分為(I)解聚酶①聚甲基半乳糖醒酸酶 Polymethlgalacturonase PMG ②聚半乳糖醒酸酶 PolygalaturonasePG ③聚甲基半乳糖醒酸裂解酶Polymethlgalacturonatelyse PMGL④聚半乳糖醒酸裂解酶Polygalaturonatelyse PGL ; (2)果膠酯酶 Pectinesterase PE。按底物不同分類可分為果膠酯酶，果膠酶，原果膠酶。但是目前國內采用的果膠酶檢測方法是次亞碘酸法(QB1502-92)，它存在以下問題1、底物無法完全溶解，配制出的底物批次間差異較大，且硫代硫酸鈉標準溶液和碳酸鈉溶液的穩定性較差，從而導致該方法的重復性很差，有時甚至會出現同一個樣品今天能檢測出酶活，明天卻檢測不出酶活的情況，對質量控制造成極大的困難。2、操作繁瑣，所需試劑較多，有效的酶液濃度范圍太窄，方法規定滴定差即消耗O.05mol/L硫代硫酸鈉溶液(A-B)之差須在O. 5-1. Oml范圍內，難以控制，經常要多次實驗才能準確測出酶活，大大增加了操作時間與難度，且勢必會增加實驗成本。3、酶活定義與現行NSP酶國家標準有沖突，一般都定義為每分鐘降解底物生成Iymol產物為I個酶活單位，但該法定義為每小時降解底物生成Img產物為I個酶活單位，造成了酶活被高估，造成用戶困擾。因此，因此，果膠酶的檢測一直是個難題，現有果膠酶檢測方法需要亟待改進。
技術實現思路
因此，本專利技術的目的是解決飼用果膠酶活性檢測困難，提供一種改進的果膠酶DNS檢測法。根據本專利技術的飼用果膠酶DNS檢測法，所述方法包括以下步驟(I)吸取果膠粉溶液，加入DNS試劑并振蕩，在37°C水浴鍋中保溫30min，再加入稀釋的酶液，混勻，沸水浴煮沸，測定在540nm處測定吸光度Ab ；(2)吸取果膠粉溶液，加入與步驟(I)稀釋同樣倍數的酶液混勻，在37°C水浴中精確保溫30min，加入DNS試劑，混勻，沸水浴煮沸，測定在540nm處測定吸光度AS ；(3)酶活計算酶活X= X 1000 X Df/30/m/MX :酶樣中果膠酶活力，U/mL ；AS :酶反應液的吸光度；AB :酶空白樣的吸光度；K :標準曲線的斜率A :標準曲線的截距；Df :稀釋倍數;M :半乳糖醛酸的分子量212. 15g/mol ；m :果膠酶取樣量，g或mL,其中，對于步驟(I)和步驟(2)，果膠粉溶液的pH為3. 5 ;果膠粉溶液與酶液的體積比為3 :1 ;在果膠粉溶液與酶液的混合液中，果膠粉的濃度為2. 25mg/mL。根據本專利技術的方法，對于步驟(I)和步驟(2)，在沸水浴煮沸的時間為5min，然后用自來水冷卻至室溫，加水定容并振蕩混勻，IOOOOg離心lOmin。因此，根據本專利技術的飼用果膠酶DNS檢測法，其酶活定義為Ig酶粉或ImL酶液在ρΗ3· 5、37 V下，每分鐘從濃度為2. 25mg/mL的底物(SigmaP9135)溶液中分解釋放Iymol還原物質(表述為半乳糖醛酸)所需要的酶量為一個 酶活單位U。根據本專利技術的飼用果膠酶DNS檢測法的原理為果膠酶能將果膠降解成寡糖和單糖。具有還原性末端的寡糖和有還原基團的單糖在沸水浴條件下可以與DNS試劑發生顯色反應。反應液顏色的強度與酶解產生的還原糖量成正比，而還原糖的生成量又與反應液中果膠酶的活力成正比。因此，通過分光比色測定反應液顏色的強度，可以計算反應液中果膠酶的活力。根據本專利技術的飼用果膠酶DNS檢測法確定了以下反應體系及反應條件反應溫度一般飼用果膠酶最適溫度在45_60°C之間，但應用環境(畜禽體溫)在37-40°C，檢測酶活是為了更好的表示其應用效果，故反應溫度應該與實際應用溫度保持一致，故選擇37 °C。反應pH值畜禽胃腸道pH值為2. 0-5. 5，反應pH應該與實際應用環境中pH保持一致，故選擇pH 3. 5。底物濃度QB 1502-92中規定果膠粉為10g/L，采用這個濃度的底物，樣品空白值會比較高，且由于果膠粉不易溶解，此空白值也不穩定，嚴重影響方法的重復性。通過酶促反應動力學計算出果膠酶反應的Km值，再結合樣品空白值的高低及檢測結果的穩定性，最終選取了在果膠粉溶液與酶液的混合液中果膠粉的濃度為2. 25mg/mL。酶液與底物比例(體積比3 :1):按照酶促反應動力學所得Km值為1. 21，底物濃度應該選擇10倍Km以上才能保證反應中底物過量，但是實際操作中底物濃度過高會造成空白吸光值太高，影響檢測靈敏度及取值范圍，因此選擇稍低的底物濃度，以此來保證較低的空白值及相對過量的底物。檢測波長根據波長掃描結果，產物在380_650nm之間均有吸收，最大吸收峰在450nm左右,但在410_480nm干擾較大,500-600nm之間數據較穩定波動小，并且梯度間吸光值差異明顯，在這個范圍取值都可以，選取了 540nm。根據本專利技術的方法可以確保此方法的重復性及重現性符合國家標準。根據現有的DNS方法檢測果膠酶活性，果膠粉難溶于水，需加熱煮沸才能完全溶解，但不同批次配制的底物間仍會存在一定差異；另外，在堿性環境中果膠粉不穩定，容易降解成一些絮狀物質，該方法中空白樣品中果膠粉會與堿性的DNS接觸，造成重復性及重現性變差。本專利技術的檢測果膠酶活性的DNS檢測法確定了反應體系包括反應溫度、反應pH值、底物濃度、酶液與底物比例、反應總體系等各種參數；確保該方法操作簡便，且重復性好。通過實驗驗證，空白樣品中通過先添加底物與DNS接觸，讓果膠粉在堿性環境中趨于穩定，不僅可降低空白值，數據也更穩定；另外，反應完成后經過IOOOOrpm離心IOmin也提高了方法的穩定性。附圖說明圖1為標準曲線。具體實施例方式實施例11、酶活定義 Ig酶粉或ImL酶液在ρΗ3· 5、37 V下，每分鐘從濃度為2. 25mg/mL的底物(SigmaP9135)溶液中分解釋放Iymol還原物質(表述為半乳糖醛酸)所需要的酶量為一個酶活單位U。2、測定原理果膠酶能將聚半乳糖醛酸降解成寡糖和單糖。具有還原性末端的寡糖和有還原基團的單糖在沸水浴條件下可以與DNS試劑發生顯色反應。反應液顏色的強度與酶解產生的還原糖量成正比，而還原糖的生成量又與反應液中果膠酶的活力成正比。因此，通過分光比色測定反應液顏色的強度，可以計算反應液中果膠酶的活力。3、試劑與溶液除特殊說明外，所用的試劑均為分析純，水均為符合GB/T6682中規定的三級水。3.1氫氧化鈉溶液，c (NaOH)為200g/L 稱取氫氧化鈉20. 0g，加水溶解，定容至100mL。3. 2D-半乳糖醛酸，c(C6HltlO7 -H2O)為1. Omg/mL 稱取D-半乳糖醛酸O. 100g，加水溶解，定容至100mL。3. 30. lmol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH=3. 5)甲液稱取檸檬酸(C6H8O7 · H2O) 21. 01g，用水溶解并定容至1000mL。乙液稱取檸檬酸三鈉(本文檔來自技高網...
【技術保護點】
飼用果膠酶DNS檢測法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：（1）吸取果膠粉溶液，加入DNS試劑并振蕩，在37℃水浴鍋中保溫30min，再加入稀釋的酶液，混勻，沸水浴煮沸，測定在540nm處測定吸光度AB；（2）吸取果膠粉溶液，加入與步驟（1）稀釋同樣倍數的酶液混勻，在37℃水浴中精確保溫30min，加入DNS試劑，混勻，沸水浴煮沸，測定在540nm處測定吸光度AS；（3）酶活計算酶活X=[(AS?AB)×K+CO]×1000×Df/30/m/MX：酶樣中果膠酶活力，U/mL；AS：待測酶反應液的吸光度；AB：待測酶空白樣的吸光度；K：標準曲線的斜率；CO：標準曲線的截距；Df：待測酶樣品的稀釋倍數；M：半乳糖醛酸的分子量，212.15g/mol；m：待測果膠酶取樣量，其中，對于步驟（1）和步驟（2），果膠粉溶液的pH為3.5；果膠粉溶液與酶液的體積比為3：1；在果膠粉溶液與酶液的混合液中，果膠粉的濃度為2.25mg/mL。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：王冠，詹志春，徐麗，周櫻，丁皓，付大波，周金敏，王曉亮，張慶麗，
申請(專利權)人：武漢新華揚生物股份有限公司，
類型：發明
國別省市：
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