C反應蛋白標準物質定值的方法技術

本發明專利技術提供一種C反應蛋白標準物質定值的方法，C反應蛋白（C-reactionprotein，CRP）在1930年由Tillet和Francis發現。CRP是機體受到微生物入侵或組織損傷等炎癥性刺激時肝細胞合成的急性相蛋白。在實際檢測工作中，主要是采用C反應蛋白分析儀對C反應蛋白進行測定，其均需要使用C反應蛋白標準物質，但是對于其標準物質定值是否準確的研究現在還很少。本發明專利技術所解決的技術問題是填補上述技術空白，提供一種C反應蛋白標準物質定值的方法，具有良好的準確性、可靠性和溯源性。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種標準物質的定值方法，尤其是涉及一種。
技術介紹
對通過均勻性、穩定性檢驗合格樣料的特性值進行測量，在標準物質
稱為表征化(原文為characterize，即對材料特性進行測量)；由計量權威部門對表征化獲得的樣料特性的量值進行計量學溯源性(以下簡稱溯源性)確認和相應測量不確定度評定合理性確認，在標準物質
稱為定值(原文為certify，即對測量獲得的結果進行認證確認，在其它
一般稱為認證)。因此，對有證標準物質的定值，實際上應分為兩步首先是對經過均勻性、穩定性檢驗合格的樣料特性值進行測量，也就是表征化；然后是對測量結果的溯源性和測量不確定度評定的合理性進行有效性確認。C 反應蛋白(C-reactionprotein, CRP)在 1930 年由 Tillet 和 Francis 發現。最初他們觀察到一些急性病人的血清可與肺炎鏈球菌的莢膜C-多糖發生反應，隨后證實能與C-多糖反應的物質是一種蛋白質，因而將這種蛋白質命名為C反應蛋白(C-reactionprotein,CRP)0 CRP是機體受到微生物入侵或組織損傷等炎癥性刺激時肝細胞合成的急性相蛋白。CRP的測定，可用來對下列情況治療監測(I)在許多急性感染時，作為最有效使用抗生素治療的依據。(2)在高危病人缺少微生物學診斷時，進行抗生素治療。(3)在CRP下降至正常時，中斷抗生素治療。(4)根據CRP的水平變化來決定抗炎藥物的劑量。( 5 )在有些難以進行臨床評估的風濕性疾病中，快速選擇合適的抗治療。(6)估計并發癥的開始。如在風濕性多肌痛患者中巨細胞動脈炎的發展。在實際檢測工作中，主要是采用C反應蛋白分析儀對C反應蛋白進行測定，其均需要使用C反應蛋白標準物質，但是對于其標準物質定值是否準確的研究現在還很少。
技術實現思路
本專利技術所解決的技術問題是填補上述技術空白，提供一種，具有良好的準確性、可靠性和溯源性。上述定值方法，包括以下步驟(I)合成三條特異性肽段ESDTSYVSLK、APLTKPLK、ALKYEVQGEVFTK 用于進行 C 反應蛋白定量；(2)同時使用全氘標記的亮氨基合成對應的三條同位素標記肽段；(3)以亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸和/或苯丙氨酸標準物質為標準，以同位素標記亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸和/或苯丙氨酸為內標，采用同位素稀釋質譜法對合成的三條標準肽段進行準確定量；(4)按400 μ L溶液中所含C反應蛋白質量，根據三條肽段的純度計算酶切后所得三條目標肽段的質量，配制相應濃度標準肽段及同位素內標肽段；(5)準確稱量400 μ L C反應蛋白溶液，加入并稱量相應體積的同位素內標溶液；使酶切后所得目標肽段與內標肽段摩爾比為1:1;(6)離心干燥上述已加入內標的蛋白溶液，加入100 yL的8Μ尿素溶液對蛋白進行變性處理；IOmin后加入2μ L IM的二硫蘇糖醇溶液在60攝氏度水浴中加熱60min ;然后加入2 μ L IM的碘乙酰胺,在暗處反應40min ;加入6 μ L IM的二硫蘇糖醇還原多余的碘乙酰胺；用IOOmM的碳酸氫胺溶液稀釋尿素至IM以下,加入2 μ L O. 5mg/mL的胰蛋白酶溶液進行酶切，每24小時補充2μ L的胰蛋白酶；酶切96小時后采用同位素稀釋質譜法對三條肽段進行準確定量；·(7)根據質譜所得酶切后肽段與同位素肽段的比例配制標準肽段與內標肽段比例的標準曲線；計算溶液中肽段含量，根據蛋白的分子量計算每400 μ L溶液中C反應蛋白的濃度作為標準物質的定值結果。其中本專利技術中使用的C反應標準物質制備過程(I)配制濃度為 20mmol/L 的 Tris-HCl (ρΗ7· 5)，O. 35moL/NaCl, 2mmol/L CaCl2 溶液，0. 5%NaN3用于溶解經過純化的CRP。(2)配制濃度為50 μ g / g CRP溶液。(3)將CRP溶液分裝至500 μ L凍存管中，每只凍存管中分裝400 μ L溶液，分裝好的標準物質在一 80攝氏度冰箱中冷凍保存。采用上述技術方案，本專利技術可以達到的技術效果是(I)采用Tris-HCl，NaCl, CaCl2, NaN3溶解制備CRP標準物質，提高了 CRP溶解度，保證了標準物質的均勻性；(2)采用同位素稀釋質譜基準方法對標準肽段和CRP蛋白質含量進行測定，保證了定值結果的準確；(3)在采用同位素稀釋質譜法對標準肽段定量時同時選用多個氨基酸定量結果的平均值；在采用同位素稀釋質譜法對CRP定量時同時選用三條酶切肽段定量結果的平均值，提高了定值結果的可靠性。(4)標準物質定值結果可最終溯源到SI單位。具體實施例方式為進一步說明本專利技術，結合以下實施例具體說明實施例1: (一)C反應標準物質制備過程(I)配制濃度為 20mmol/L 的 Tris-HCl (ρΗ7· 5)，O. 35moL/NaCl, 2mmol/L CaCl2 溶液，0. 5%NaN3用于溶解經過純化的CRP。(2)配制濃度為50 μ g / g CRP溶液。(3)將CRP溶液分裝至500 μ L凍存管中，每只凍存管中分裝400 μ L溶液，分裝好的標準物質在一 80攝氏度冰箱中冷凍保存。(二)標準物質定值(I)選擇檢測 ESDTSYVSLK, APLTKPLK, ALKYEVQGEVFTK 三條特異性肽段進行 CRP 蛋白定量。(2)合成上述三條肽段，同時使用全氘標記的亮氨基合成對應的三條同位素標記肽段。(3)以國家亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸和/或苯丙氨酸標準物質為標準，以同位素標記亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸和/或苯丙氨酸為內標，采用同位素稀釋質譜法對合成的三條標準肽段進行準確定量。(3)按400μ L溶液中所含CRP蛋白質量，根據三條肽段的純度計算酶切后所得三條目標肽段的質量，配制相應濃度標準肽段及同位素內標肽段。(4)準確稱量400 μ L蛋白溶液，加入并稱量相應體積的同位素內標溶液。使酶切后所得目標肽段與內標肽段摩爾比盡量為1:1。 (5)離心干燥加入內標的蛋白溶液，加入100 μ L的8Μ尿素溶液對蛋白進行變性處理。IOmin后加入2 μ L IM的二硫蘇糖醇(DTT)溶液在60攝氏度水浴中加熱60min。然后加入2yL IM的碘乙酰胺(IAA)，在暗處反應40min。加入6yL IM的DTT還原多余的IAA。用IOOmM的碳酸氫胺溶液稀釋尿素至IM以下,加入2 μ L O. 5mg/mL的Trypsin溶液進行酶切，每24小時補充2μ L的Trypsin。酶切84小時后采用同位素稀釋質譜法對三條肽段進行準確定量。(6)根據質譜所得酶切后肽段與同位素肽段的比例配制標準肽段與內標肽段比例的標準曲線。計算溶液中肽段含量，根據蛋白的分子量計算每400 μ L溶液中CRP蛋白的濃度作為標準物質的定值結果。(三)實施例中使用的儀器(I)分析天平(Sartorius BS323S 型，最大稱量為 320g，精度為 O. OOlg，德國)(Sartorius ME235S 型，最大稱量為 230g，精度為 O. Olmg，德國)(METTLER TOLEDO XP26 型，最大稱量為 22g，精度為 0. OOlmg,瑞士)(METTLER TOLEDO UMX2 型，最大稱量為 2.本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種C反應蛋白標準物質定值的方法，其特征在于：包括以下步驟：(1)合成三條特異性肽段：ESDTSYVSLK、APLTKPLK、ALKYEVQGEVFTK用于進行C反應蛋白定量；(2)同時使用全氘標記的亮氨基合成對應的三條同位素標記肽段；(3)以亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸和/或苯丙氨酸標準物質為標準，以同位素標記亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸和/或苯丙氨酸為內標，采用同位素稀釋質譜法對合成的三條標準肽段進行準確定量；(4)按400μL溶液中所含C反應蛋白質量，根據三條肽段的純度計算酶切后所得三條目標肽段的質量，配制相應濃度標準肽段及同位素內標肽段；(5)準確稱量400μL?C反應蛋白溶液，加入并稱量相應體積的同位素內標溶液；使酶切后所得目標肽段與內標肽段摩爾比為1:1；(6)離心干燥上述已加入內標的蛋白溶液，加入100μL的8M尿素溶液對蛋白進行變性處理；10min后加入2μL?1M的二硫蘇糖醇溶液在60攝氏度水浴中加熱60min；然后加入2μL?1M的碘乙酰胺，在暗處反應40min；加入6μL?1M的二硫蘇糖醇還原多余的碘乙酰胺；用100mM的碳酸氫胺溶液稀釋尿素至1M以下，加入2μL?0.5mg/mL的胰蛋白酶溶液進行酶切，每24小時補充2μL的胰蛋白酶；酶切96小時后采用同位素稀釋質譜法對三條肽段進行準確定量；(7)根據質譜所得酶切后肽段與同位素肽段的比例配制標準肽段與內標肽段比例的標準曲線；計算溶液中肽段含量，根據蛋白的分子量計算每400μL溶液中C反應蛋白的濃度作為標準物質的定值結果。...

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：宋德偉，李紅梅，徐蓓，
申請(專利權)人：中國計量科學研究院，
類型：發明
國別省市：