本發明專利技術提供了一種食管癌免疫質譜檢測試劑盒，所述檢測試劑盒含有保藏號為CGMCC?No.5269的雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體和固相載體，所述單克隆抗體固定于所述固相載體上。本發明專利技術所涉及的單克隆抗體針對多肽標志物抗原的結合特異性強；采用免疫與質譜技術連用，能實現食管癌高通量、高靈敏度、高精確度的檢測。此外，本發明專利技術屬于分子水平診斷技術，與腫瘤影像學相比操作簡單、成本低。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物技術及質譜檢測，具體地說，涉及一種食管癌免疫質譜檢測試劑盒。
技術介紹
食管癌是常見的消化道惡性腫瘤。據統計，2008年全球食管癌新發病例為 482300,死亡病例為406800。食管癌分為食管癌和食管腺癌,在我國，食管癌是食管癌的主 要類型，尤其是在北方地區。近年來，雖然對食管癌的治療取得了一些進展，但是食管癌的 死亡率仍居高不下。究其原因，主要是其早期癥狀具有隱蔽性和非特異性，臨床發現和治療 的食管癌患者大多已屬中、晚期，早期食管癌與中、晚期食管癌的預后有很大差別，經綜合 治療的早期食管癌患者5年生存率可達90%以上，而中、晚期患者只有25%-40%。因此，開展 食管癌的早期診斷早期治療是目前提高食管癌治療效果的有效途徑。而當食管病變局限于 黏膜或黏膜下時，患者可能尚無感覺或僅有諸如輕微的梗噎感、胸骨后燒灼感等非特異性 癥狀，使早期診斷食管癌非常困難。目前，國內外常采用的食管癌檢測方法有脫落細胞學、內鏡技術、標志物檢查等方 法。食管上皮脫落細胞的獲取方法有食管拉網及毛刷，經鹽水沖洗、沉淀后做涂片檢查。食 管拉網法是我國沈瓊教授專利技術的，其特異度可達99%，敏感度為44%-90%，但由于這一方法 使受檢者較為痛苦，難以作為普查手段在一般人群中開展，經過半個多世紀的實踐發現， 在高發區食管拉網方法的受檢率越來越低。內鏡檢查并進行活檢是現今食管癌的主要確診 手段，且隨著其他技術與內鏡的結合，產生了一些新的檢查方法，明顯提高了早期食管癌的 檢出率，但其依然存在明顯的缺陷，如可能會加重受檢者的不適，診斷結果依賴于操作者的 經驗和技巧等。運用組織標志物診斷食管癌，前提必然是要取得腫瘤組織或細胞，這只能通 過有創的、甚至繁瑣的操作才能達到，并不適合人群普查。所以，積極尋找創傷小、檢測方 便的食管鱗癌血清標志物檢測方法成為當今臨床診斷的熱點。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種食管癌免疫質譜檢測試劑盒。為了實現本專利技術目的，本專利技術的一種食管癌免疫質譜檢測試劑盒，其含有保藏號 為CGMCC No. 5269的雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體和固相載體，所述單克隆抗體共價連 接于固相載體上。其中，所述固相載體為包被蛋白G或蛋白A的瓊脂糖顆粒等。優選地，所述單克隆抗體可固定于固相載體上，如通過共價連接方式固定于包被 蛋白G或蛋白A的瓊脂糖顆粒上。本專利技術選用的包被蛋白G或蛋白A的瓊脂糖顆粒(Protein GAgarose/Protein A Agarose)是免疫沉淀的基質,與包被蛋白G或蛋白A的磁珠(Protein G magnetic beads/ Protein A magnetic beads)相比，更具成本低的優點。進一步地，本專利技術的食管癌免疫質譜檢測試劑盒中還含有洗脫液，所述洗脫液任選 pH 值 2. 7 的 O. lmol/1 甘氨酸-HCl 溶液、5% 乙酸或含 O. l%(v/v) TFA 的 50-70% (v/v) ACN 溶液中的一種。本專利技術中，抗人食管癌多肽標志物單克隆抗體雜交瘤細胞株AP0105，是以多肽標志物抗原(序列為 Asn-Leu-Gly-His-Gly-His-Lys-His-Glu-Arg-Asp-Gln-Gly-His-Gly-Hi s-Gln的多肽，命名為多肽5)與載體蛋白匙孔血藍蛋白(KLH)的偶聯物免疫原，免疫BALB/ C小鼠，然后篩選出的雜交瘤細胞株。本專利技術提供的抗人食管癌多肽標志物單克隆抗體雜交瘤細胞株AP0105 (即，抗人原發性肝癌多肽標志物單克隆抗體雜交瘤細胞株AP0105)現已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區北辰西路 I號院3號中國科學院微生物研究所，郵編100101，保藏日期2011年9月27日，保藏號為 CGMCC No. 5269。本專利技術還提供所述多肽免疫檢測試劑盒的制備方法，該方法包括如下步驟將純化后的單克隆抗體與固相載體懸浮液混合，使得終濃度為O. 15 μ g/μ L-1. 5 μ g/μ L，在 4°C旋轉孵育15分鐘-2小時，放置l_5min，沉淀，移出上清液，用100-200 μ L PBS緩沖液 (O. Olmol/1、ρΗ7. 4)清洗所述固相載體2_5次，即得所述檢測試劑盒。本專利技術還提供一種食管癌免疫質譜檢測方法，該方法包括如下步驟利用上述檢測試劑盒從血清樣品中分離多肽標志物抗原，用高通量的MALD1-T0F-MS檢測洗脫液中的所述多肽標志物抗原，由此建立完整的多肽免疫質譜檢測方法。為了將所述檢測試劑盒中的與所述單克隆抗體原發生特異性結合的血清樣品中的多肽標志物抗分離出來，使用洗脫液從所述固相載體上分離出所述多肽標志物抗原。具體地，所述食管癌免疫質譜檢測方法包括如下步驟I)結合單克隆抗體與瓊脂糖顆粒以共價鍵相互結合； 2)孵育將樣品與結合了抗體的瓊脂糖顆粒進行孵育；3)清洗經過孵育，使得待分析物結合到抗體上，并清洗瓊脂糖，洗掉未與抗體結合的雜質；4)洗脫用洗脫液將待分析物洗脫下來；5)檢測用MALD1-TOF MS檢測，并對數據進行分析。優選地，所述食管癌免疫質譜檢測方法包括如下步驟I)取15-25 μ I固相載體，置于Eppendorf管中，加入1. 56 μ g-31.1yg單克隆抗體，4°C旋轉混合15分鐘-2小時，放置l_5min，移出上清液，用O. 01M、pH7. 4PBS緩沖液 100-200 μ L清洗所得固相載體沉淀2-5次；2)取O. 48 μ g-24 μ g多肽標準品、10-50 μ L PBS，與步驟I)清洗后的所述固相載體混合，4°C旋轉混合8-12h ；3)放置l_5min，移出上清液，用100-200 μ L PBS清洗沉淀2_5次；最后一次清洗時將其懸浮液移至另一干凈Eppendorf管中；以避免抗原非特異附著在管壁，降低檢測本底值；4)加入5-10 μ L洗脫液，吸排混合l_5min ；5)離心，取上清液，用MALD1-T0F-MS檢測，得到多肽標準品質譜；6 )用40_60 μ I血清樣品替代步驟2 )的多妝標準品，重復步驟2 ) _5 ),用MALD1-TOF-MS檢測，測定血清樣品中的多肽標志物抗原。其中，步驟5)中采用的檢測條件為正離子檢測模式，離子源加速電壓為201^，隊激光器，激光波長337nm,能量2000,離子延遲提取時間(Pulse ion extraction, PIE) 390ns, 質譜信號單次掃描累加2000次,使用peptide II standard kit (Bruker)離子峰校正(m/ z 700-m/z3500)，質量掃描范圍 500_5000Da。本專利技術的食管癌免疫質譜檢測方法操作簡單，主要包括抗體固相化、多肽抗原孵育結合和質譜檢測三個方面，即將包被蛋白G或蛋白A的瓊脂糖顆粒與本專利技術的單克隆抗體混合孵育，抗體與蛋白G或蛋白A親和結合后固相化，清洗，加入多肽抗原孵育，抗原與抗體特異性結合，清洗，洗脫液分離抗原，MALD1-T0F-MS檢測。本專利技術中涉及的單克隆抗體針對多肽標志物抗原的結合特異性強；采用免疫與質譜技術連用，能實現食管癌高通量、高靈敏度、高精確度的檢測。此外，本專利技術方法屬于分子水平診斷技術，與腫瘤本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種食管癌免疫質譜檢測試劑盒，其特征在于，其含有保藏號為CGMCC?No.5269的雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體和固相載體，所述單克隆抗體固定于所述固相載體上。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：魏開華，肖漢族，孫云波，傅海媛，侯利平，黃亞娟，宋純艷，楊保安，甄蓓，徐淑芳，張拓，王東茂，周曉明，原劍，
申請(專利權)人：北京正旦國際科技有限責任公司，湖南金健藥業有限責任公司，
類型：發明
國別省市：
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