本發明專利技術提出一種人胎盤來源的MSCs體外表現為抑制T細胞活性及增殖作用機制的檢測方法。鑒于協同共刺激分子在T細胞活化增殖中所起的重要作用，本發明專利技術大膽推測胎盤來源的MSCs體外表現出對T細胞負性調控作用可能系其高表達負性協同刺激分子PD-L1有關，首先通過實驗驗證PMSCS對活化T細胞具有明顯抑制作用，再以負性協同刺激分子PD-L1為切入點，通過流式細胞儀檢測、免疫熒光染色、3H-TdR摻入法、ELISA等實驗分析PD-L1在PMSCS介導的T細胞體外增殖抑制作用中所扮演的角色，從而驗證PD1-PD-L1分子通路是PMSCS體外調節T細胞免疫耐受的主要信號機制。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物技術及免疫學領域，特別涉及一種人類AECS體外免疫抑制作用分子機制的檢測方法。
技術介紹
協同共刺激分子在T淋巴細胞的活化增殖中起到很重要的作用。“協同刺激信號”是1970年由Bretseher和Cohn在T細胞活性雙信號模型的基礎上提出的，即除了通過APC遞呈MHC處理過的抗原給抗原特異性T細胞提供第一個信號外，還需協同刺激分子作為輔助信號的協同作用，達到生理活化閾值后才能使T細胞產生正常的免疫調節機制。如果缺乏協同共刺激分子的第二信號，將會導致調節性T細胞的無反應性或特異性免疫耐受。B7家族是唯一能從APC單向傳送信號至T細胞的協同共刺激分子，PD-Ll是B7家族一個重要的負性協同刺激分子，抑制T細胞的活化增殖，在機體免疫應答中發揮了重要的調節作用。以往的實驗已經驗證了 AECS低表達HLA-DR，并對活化的T細胞具有抑制作用，但AECS是否表達與T細胞活化或抑制相關的協同刺激分子以及其中的機理，未見相關的文獻報道。以負性協同刺激分子ro-Ll為切入點，通過流式細胞儀檢測、免疫熒光染色、3H-TdR摻入法、ELISA等實驗分析TO-Ll在AECS介導的T細胞體外增殖抑制作用中所扮演的角色，從而驗證HH-PD-Ll分子通路是AECS體外調節T細胞免疫耐受的主要信號機制。
技術實現思路
本專利技術提出一種人類AECS體外免疫抑制作用分子機制的檢測方法，首先在體外分離及培養人AECS，應用免疫熒光染色方法檢測AECS表面負性協同刺激分子I3D-Ll的表達，通過I3D-LlmAb阻斷實驗，AECS與T細胞體外共培養觀察T細胞增殖及細胞周期、細胞因子分泌情況等證實其對T淋巴細胞的抑制作用及內在的分子機制，整個驗證過程將包括如下步驟S1:羊膜上皮細胞分離培養與鑒定；選用剖宮產后的人羊膜，大小約15*15cm，分離、去除殘留的絨毛膜，PBS (Gibco BRL公司)，洗盡血跡后用O. 125%胰酶，37° C消化IOmin,重復4次，IOOOrpm,離心6min收集，用PBS洗3次后接種在含10%FBS+RPMI1640培養皿中，于37° C含5%C02空氣的培養箱內培養。每3-4d進行換液，待細胞生長鋪滿至瓶底80% -90%時傳代，培養第二代的細胞用于實驗。用于實驗之前的細胞進行流式細胞儀檢測細胞表型，先將細胞用胰蛋白酶消化，用PBS液調整細胞濃度為IxlO6 / ml。分別加入下列鼠抗人單克隆抗體CD29. FITC、CD34-FITC、CD44-PE、CD45-PE、CD73-PE、CD90-PE、CD105-FITC、CD106-PE、CD166-FITC、HLA-DR-PE、置 4° C 孵育 30min，PBS 洗 2 遍，直接進行流式細胞儀分析。S2 :免疫熒光染色法檢測AECS中TO-Ll表達；將以多聚賴氨酸處理的蓋玻片置于六孔培養板中，取2代細胞種于此六孔板中。I 2d后吸取培養基，加入4%的多聚甲醛固定細胞，用PBS沖洗后，加入抗人I3D-LlmAb后置于濕盒中4° C過夜，沖洗后再加入PE熒光二抗，置室溫Ih,最后加入Hoechst33258五分鐘。用50%甘油封片,用突光顯微鏡觀察。S3 =PD-LlmAb阻斷AECS對T細胞增殖的抑制作用檢測；將2代的AECS用絲裂霉素(IOng / ml)處理，PBS洗三遍,接種于96孔板中IxlO4 /孔，每孔加入T細胞IxlO5 /孔，同時加入 PHA (50 μ g / ml)，實驗分為 5 組T、T+PHA、T+PHA+AECS、T+PHA+AECS+antiPDLl、T+PHA+AECS+mlgG組；將細胞于37° C、5 % C02條件下培養72h。在結束前18h加入3H-TdRd U Ci /孔)，收集細胞,用β液體閃爍計數儀檢測cpm值,根據cpm值的大小,進行分析比較。S4 =AECS與T細胞體外共培養及I3D-Ll阻斷實驗；取二代AECS，用IOug / ml的絲裂霉素處理lh，胰酶消化，洗滌5遍，用含有10% FBS的LG-DMEM完全培養基調整濃度為1.OXlO5 /孔，接種于24孔培養板中。接種T細胞7xl06 / ml，加入PHA(30 μ g / ml)或和PD-LlmAbdOy g / ml)同時加入。實驗分組為 T、T+AECS、T+PHA+AECS、T+PHA+AECS+PD_L1、T+PHA+AECS+mlgG、AECS。24h 后觀察細胞形態。S5 T細胞活性早期標志⑶69的檢測；24h后收集各組細胞，調整細胞密度，加入⑶4-FITC、⑶69-PE表記的抗體，進行雙標。4° C避光，30分鐘，PBS洗兩遍，上機檢測。S6 =AECS對活化T細胞周期影響的檢測；收集上述細胞，PBS洗滌后，70%酒精固定過夜。PBS洗三遍，加入細胞周期染液(PI50yg / ml、RNA酶50yg / ml) O. 5ml, 37° C孵育30min，流式細胞儀分析。S7 =AECS對活化T細胞細胞因子分泌影響的檢測；將上述細胞上清收集并分裝保存，-20°C _80°C保存待檢。IFN- Y、IL-10的檢測采用ELISA法，步驟按照試劑盒說明書操作。所述實驗流程中所使用的人外周血T淋巴細胞分離純化的步驟具體如下取健康人外周血(血 樣來自自愿者)用淋巴細胞分離液常規分離外周血單個核細胞，貼壁2h后，吸出富集的T細胞，再經磁珠分選純化。純化后的T細胞純度達95%以上。本專利技術以免疫調控信號機制作為出發點，對AECS在體外所表現出來的免疫抑制特性其內在的分子機制作了探討，從而成功地明確了負性協同刺激分子ro-Ll—PDl分子信號通路是主要的調控位點，該專利技術為進一步深入探討機體的復雜免疫調控網絡提供了很好的線索。附圖說明通過下面結合附圖的詳細描述，本專利技術前述的和其他的目的、特征和優點將變得顯而易見。其中圖1為人類AECS體外培養形態的顯微放大圖；圖2為流式細胞儀測定AECS表面協同刺激分子的表達情況；圖3為I3D-LlmAb部分阻斷AECS對T細胞增殖的抑制效應；圖4為I3D-LlmAb部分逆轉AECS對T細胞活化增殖的抑制效應；圖5為TO-LlmAb部分逆轉AECS對活化T細胞周期的阻滯；圖6為I3D-LlmAb調節AECS對T細胞體外細胞因子的分泌；圖7為整個實驗驗證過程流程示意具體實施例方式本專利技術的一種人類AECS體外免疫抑制作用分子機制的檢測方法，其研究目的是進一步了解人類羊膜細胞免疫調控能力及其可能的效應機制，為該技術最終應用于臨床、拓展其臨床應用適應癥提供理論依據。本實驗米用的材料和設備包括倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)、C02培養箱(法國Jouan公司)、恒溫離心機(法國Jouan公司)、流式細胞儀(美國Beckman. Coulter公司)、培養瓶和培養板(美國Cotingcostar公司)、β液體閃爍計數儀(瑞典Pharmacia, Uppsala公司)、LG—DMEM培養基(Hyclone公司)，胎牛血清(Hyclone公司)，胰蛋白酶(Sigma 公司)，DMEM(Gibco 公司)，鼠抗人 PD1、CD80、CD83、CD86、CD4、CD69 克隆抗體(eBioscienee本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種人類AECS體外免疫抑制作用分子機制的檢測方法，其包括下述步驟：?S1：羊膜上皮細胞分離培養與鑒定；?S2：免疫熒光染色法檢測羊膜上皮細胞中PD?L1表達；?S3：PD?L1mAb阻斷AECS對T細胞增殖的抑制作用檢測；?S4：AECS與T細胞體外共培養及PD?L1阻斷實驗；?S5：T細胞活性早期標志CD69的檢測；?S6：AECS對活化T細胞周期影響的檢測；?S7：AECS對活化T細胞細胞因子分泌影響的檢測。
【技術特征摘要】
1.一種人類AECS體外免疫抑制作用分子機制的檢測方法，其包括下述步驟 S1:羊膜上皮細胞分離培養與鑒定； 52:免疫熒光染色法檢測羊膜上皮細胞中ro-Ll表達； 53=PD-LlmAb阻斷AECS對T細胞增殖的抑制作用檢測； 54=AECS與T細胞體外共培養及I3D-Ll阻斷實驗； 55T細胞活性早期標志⑶69的檢測； 56=AECS對活化T細胞周期影響的檢測； 57=AECS對活化T細胞細胞因子分泌影響的檢測。2.如權利要求1所述的一種人類AECS體外免疫抑制作用分子機制的檢測方法，其中所述步驟IAECS的分離及培養過程如下選用剖宮產后的人...
【專利技術屬性】
技術研發人員：徐杰，房文峰，朱愛華，
申請(專利權)人：吳衛江，
類型：發明
國別省市：
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