焦磷酸測序技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥性的方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)提供一種焦磷酸測序技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥性的方法，包括以下順序步驟：步驟1，對KatG基因進行PCR擴增；步驟2，對PCR擴增產(chǎn)物進行焦磷酸測序，判斷KatG基因是否具有突變位點；其中焦磷酸測序采用SNP模式、核苷酸加樣順序為GTCACAGTCTG。本發(fā)明專利技術(shù)提供的檢測結(jié)核分枝桿菌對異煙肼耐藥性的方法可以從患者痰標本直接進行耐藥性檢測，無需再做分離培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌菌株，相比現(xiàn)在常用檢測方法可以縮短檢測時間，減少焦磷酸序列測定所需要的反應(yīng)次數(shù)和檢測試劑用量。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及一種檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥性的方法，尤其涉及一種使用焦磷酸測序方法從痰標本中直接檢測結(jié)核分枝桿菌對異煙肼耐藥突變的引物和檢測方法。
技術(shù)介紹
異煙肼(NH)作為一種高效特異的抗結(jié)核藥物，它主要通過結(jié)核桿菌內(nèi)過氧化氫-過氧化物酶(由KatG基因編碼)的作用下才能轉(zhuǎn)化為活性形式作用于enoyl-ACP還原酶，抑制桿菌酸和細胞壁合成。由于KatG蛋白是唯一可以激活異煙肼的酶，所以其功能的下降或缺失必然會造成結(jié)核菌異煙肼耐藥性，進一步的研究發(fā)現(xiàn)造成臨床異煙肼耐藥性的主要原因不僅是KatG基因的完全缺失、點位突變、堿基的插入和缺失同樣重要。目前，前期建立的焦磷酸測序結(jié)核桿菌異煙肼耐藥性檢測方法是從結(jié)核分枝桿菌痰標本培養(yǎng)物中進行檢測，但結(jié)核桿菌分離培養(yǎng)的過程至少需時I月，嚴重制約了分子生物學(xué)檢測手段快速的優(yōu)越性，如果能從痰標本中直接進行耐藥性檢測，則可以大大縮短藥敏結(jié)果的時間，對臨床指導(dǎo)價值更大。但由于痰標本中所含菌量遠遠低于痰標本純培養(yǎng)物，用以前的方法僅進行一輪PCR擴增，所得PCR產(chǎn)物濃度過低，遠遠達不到焦磷酸測序檢測的要求，無法實現(xiàn)在痰標本中的檢測。中國專利CN1311435披露了一種結(jié)核分支桿菌耐藥性檢測芯片，其中在一經(jīng)修飾的載玻片上，固定有一系列寡核苷酸點陣探針。在檢測芯片中所說的探針是針對rpoB基因、katG基因、inhA基因、kasA基因，每個探針長度至少為10個堿基，并且各個探針長度相同；突變點盡可能位于探針中間。在《中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志》2011年第2期中刊登了“焦磷酸測序技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌四種藥物耐藥 性”一文，其中利用焦磷酸測序技術(shù)以10株已知藥敏結(jié)果和經(jīng)直接測序已知耐藥基因突變情況的MTB為試驗菌株，摸索焦磷酸測序檢測MTB rpoB、katG、gyrA、rrs耐藥基因的最佳模式，并用該條件檢測89株MTB臨床分離株，并將檢測結(jié)果與BACTEC960藥敏法進行比較，以便得到最佳的檢測方法。在現(xiàn)有常規(guī)檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥性的方法中，都不可以避免需要事先對患者痰標本進行分離培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌菌株，這就使得檢測時間增長，檢測中需要進行反應(yīng)的次數(shù)也比較多，使得不能快速得出耐藥性的結(jié)果。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)目的在于提供一種利用焦磷酸測序方法從痰標本中直接檢測結(jié)核分枝桿菌對異煙肼耐藥突變的引物和檢測條件。為了實現(xiàn)上述本專利技術(shù)提供一種，包括以下順序步驟 步驟I，對KatG基因進行PCR擴增；步驟2，對PCR擴增產(chǎn)物進行焦磷酸測序，判斷KatG基因是否具有突變位點；其中焦磷酸測序采用SNP模式、核苷酸加樣順序為GTCACAGTCTG。在上述提供的中，其中針對KatG基因315位點進行焦磷酸測序并設(shè)計引物。在上述提供的中，所述對KatG基因進行PCR擴增進行兩次PCR擴增，其中第一次擴增以痰標本結(jié)核桿菌DNA提取物為模板，第二次擴增以第一次擴增PCR產(chǎn)物為模板。在上述提供的中，其中第一次擴增使用的第一 PCR引物具有SEQ ID NO.1或SEQ ID NO. 2所示序列，所述第二次擴增使用的第二 PCR引物具有SEQ ID NO. 3所示序列或帶有生物素標記的具有SEQ ID NO. 2所示序列。在上述提供的中，其中所述第一 PCR引物和第二 PCR引物的濃度為O. 4 μ ml/L。在上述提供的中，其中在焦磷酸測序中用的測序引物具有SEQ ID NO. 4所示序列。在上述提供的中，其中所述擴增反應(yīng)過程包括下列順序步驟 步驟1:在94°C下進行預(yù)熱5分鐘； 步驟2 :在95°C下保持30秒進行變性、61°C下保持30秒進行退火、72°C下保持30秒進行擴增和延伸，循環(huán)退火過程40次； 步驟3 :在72°C下保持10分鐘。`本專利技術(shù)提供的檢測結(jié)核分枝桿菌對異煙肼耐藥性的方法可以從患者痰標本直接進行耐藥性檢測，無需再做分離培養(yǎng)結(jié)核分歧桿菌菌株，相比現(xiàn)在常用檢測方法可以縮短檢測時間，減少焦磷酸序列測定所需要的反應(yīng)次數(shù)和檢測試劑用量。附圖說明圖1是本專利技術(shù)中用SNP模式對異煙肼KatG基因315位點痰標本焦磷酸測序結(jié)果。圖2是本專利技術(shù)中用SNP模式對異煙肼KatG基因315位點痰標本焦磷酸測序另一結(jié)果。圖3是本專利技術(shù)中用SNP模式對異煙肼KatG基因315位點標準株焦磷酸測序結(jié)果。具體實施例方式由于KatG基因的突變主要集中于315位點，在本專利技術(shù)主要針對異煙肼KatG耐藥基因315位點進行焦磷酸測序檢測方法。本專利技術(shù)提供的一種檢測結(jié)核分枝桿菌對異煙肼耐藥性的方法，先對KatG基因進行PCR擴增，再對PCR擴增產(chǎn)物進行焦磷酸測序，判斷KatG基因是否具有突變位點；其中焦磷酸測序采用SNP模式、核苷酸加樣順序為GTCACAGTCTG。焦磷酸測序技術(shù) 焦磷酸測序(Pyrosequencing)技術(shù)是全新的一種DNA序列分析技術(shù),可以快速、準確地測定一段較短的目標片段。該技術(shù)無須進行電泳，DNA片段也無須熒光標記，操作極為簡便。焦磷酸測序技術(shù)是由4種酶催化的同一反應(yīng)體系中的酶級聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，基本原理如下將I個特異性的測序引物和單鏈DNA模板結(jié)合，然后加入酶混合物(包括DNA Polymerase、ATP Sulfurylase、Luciferase 和 Apyrase)和底物混合物(包括 APS 和Luciferin)。向反應(yīng)體系中加入I種dNTP,如果它剛好能和DNA模板的下一個堿基配對,貝U會在DNA聚合酶的作用下，添加到測序引物的3’末端，同時釋放出摩爾數(shù)的焦磷酸基團。在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS結(jié)合形成ATP ;在熒光素酶的催化下，生成的ATP又可以和熒光素結(jié)合形成氧化熒光素，同時產(chǎn)生可見光。通過CCD光學(xué)系統(tǒng)即可獲得一個特異的檢測峰，峰值的高低則和相匹配的堿基數(shù)成正比。反應(yīng)體系中剩余的dNTP和殘留的少量ATP在Apyrase的作用下發(fā)生降解。加入另一種dNTP,使第2 4步反應(yīng)重復(fù)進行，根據(jù)獲得的峰值圖即可讀取準確的DNA序列信息。每個峰值的高度與反應(yīng)中摻入的核苷酸數(shù)目成正比。然后加入下一種dNTP，繼續(xù)DNA鏈的合成。焦磷酸測序操作系統(tǒng)中共有2個模式能進行堿基突變的檢測，即序列分析模式(Sequence Analysis, SQA)和單核苷酸多態(tài)性模式(Single Nucleotide polymorphism,SNP)ο其中SQA模式的核苷酸加樣順序為循環(huán)順序加樣法，即通過循環(huán)反復(fù)的加入A、G、C、T四種核苷酸以檢測出·待檢樣品的序列，該法一次能準確判讀40bp左右的堿基，將所測定序列與已知序列比對后自行判讀突變情況。SNP模式的核苷酸加樣順序為特定順序加樣法，即系統(tǒng)根據(jù)設(shè)定的待檢位點及·位點周圍的序列自動生成核苷酸的加樣順序，僅對單個位點的堿基變化進行檢測，不對整個序列進行測定。針對不同的檢測對象，需要摸索不同的焦磷酸測序檢測方法。由于焦磷酸測序技術(shù)操作簡單，且結(jié)果準確可靠，可應(yīng)用于SNP位點檢測、等位基因頻率測定、細菌和病毒分型等領(lǐng)域。以下通過實施例對本
技術(shù)實現(xiàn)思路
作進一步的詳細說明，以便更好理解本專利技術(shù)創(chuàng)造的內(nèi)容，但是下述實施例并不限制本專利技術(shù)創(chuàng)造的保護范圍。采集檢測物 收集病人晨痰并存放在無菌樣本保存管內(nèi)，痰量以3 5mL為宜，密封后送檢。檢測物預(yù)處理和DNA本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】
一種焦磷酸測序技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥性的方法，其特征在于，包括以下順序步驟：步驟1，對KatG基因進行PCR擴增；步驟2，對PCR擴增產(chǎn)物進行焦磷酸測序，判斷KatG基因是否具有突變位點；其中焦磷酸測序采用SNP模式、核苷酸加樣順序為GTCACAGTCTG。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種焦磷酸測序技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥性的方法，其特征在于，包括以下順序步驟 步驟I，對KatG基因進行PCR擴增； 步驟2，對PCR擴增產(chǎn)物進行焦磷酸測序，判斷KatG基因是否具有突變位點；其中焦磷酸測序采用SNP模式、核苷酸加樣順序為GTCACAGTCTG。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，針對KatG基因315位點進行焦磷酸測序并設(shè)計引物。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述對KatG基因進行PCR擴增進行兩次PCR擴增，其中第一次擴增以痰標本結(jié)核桿菌DNA提取物為模板，第二次擴增以第一次擴增PCR產(chǎn)物為模板。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述第一次擴增使用的第一PCR引物具有SEQ ID NO.1或S...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：鄭瑞娟，胡忠義，周燕，王潔，秦蓮花，
申請(專利權(quán))人：上海市肺科醫(yī)院，
類型：發(fā)明
國別省市：