本發(fā)明專利技術(shù)公開了固相合成胸腺肽α1的20肽階段的缺失肽、非肽雜質(zhì)及檢測方法，包括：將固相合成胸腺肽α1的20肽采用LC/MS聯(lián)用儀進行梯度洗脫獲取離子流譜；如果所獲取的離子流譜在16.69min、17.78min、18.47min、19.54min、23.18min或24.65min分別出現(xiàn)峰面積為2.27％、1.65％、2.18％、5.79％、7.57％或2.39％的離子流峰，說明20肽含有缺失肽；如果在15.11min或16.12min時出現(xiàn)峰面積為1.46％或2.18％的離子流峰，說明20肽含有非肽雜質(zhì)。本發(fā)明專利技術(shù)可有效保障和控制固相合成胸腺肽α1中20肽階段的質(zhì)量。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及固相合成胸腺肽α I中的缺失肽、非肽雜質(zhì)及檢測方法，尤其涉及固相合成胸腺肽α I的20肽階段的缺失肽、非肽雜質(zhì)及檢測方法，屬于固相合成胸腺肽α I領(lǐng)域。
技術(shù)介紹
胸腺肽α I是從胸腺素組分5 (TF-5)中分離出的一種活性多肽，由28個氨基酸殘基組成，分子量為3108. 37。在TF-5中，胸腺肽α I的含量為O. 6%，是人體胸腺激素的重要活性組分。例如胸腺肽α I可調(diào)節(jié)T淋巴細胞發(fā)育、分化和成熟。此外，胸腺肽α I能修復(fù)受損的T淋巴細胞。雖然從TF-5中分離的胸腺肽α I無明顯毒副反應(yīng)，但由人工固相合成的市售胸腺肽αI可因不純而造成不良反應(yīng)。目前，人工固相合成胸腺肽αI的操作規(guī)程千篇一律，幾乎沒有優(yōu)化空間。市售的保護氨基酸和相關(guān)試劑的純度也足以支持人工固相合成高純度胸腺肽α 。在操作規(guī)程不出差錯的前提下，人工固相合成的胸腺肽α I是否純，取決于它含的缺失肽的狀況。與小分子藥物不同，多肽的生物活性非常強。在人工固相合成的胸腺肽α I中，SP使存在微量的缺失肽也可造成嚴重的毒副作用。控制人工固相合成的胸腺肽α I的質(zhì)量的關(guān)鍵是控制缺失肽。目前國內(nèi)外既沒有披露人工固相合成的胸腺肽α I中的缺失肽狀況，也沒有公開測定人工固相合成的胸腺肽α I中的缺失肽的方法。這種狀態(tài)不適應(yīng)胸腺肽α I的臨床地位。為了改善這種狀況，保障胸腺肽α I的臨床用藥安全性，形成了本專利技術(shù)。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的之一是提供一種能夠準確、靈敏的檢測固相合成胸腺肽α I的20肽階段是否含有缺失肽或非肽雜質(zhì)的方法；本專利技術(shù)的另一個目的是提供固相合成胸腺肽α I的20肽階段的缺失肽譜；本專利技術(shù)的目的之三是將固相合成胸腺肽α I的20肽階段的缺失肽譜應(yīng)用于胸腺肽α I固相合成中的質(zhì)量控制。本專利技術(shù)的上述目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的一種檢測固相合成胸腺肽α I的20肽階段是否含有缺失肽或非肽雜質(zhì)的方法，包括以下步驟將固相合成胸腺肽α I過程中的20肽采用LC/MS聯(lián)用儀進行梯度洗脫獲取離子流譜；如果所獲取的離子流譜在16. 69min時出現(xiàn)峰面積為2. 27%的離子流峰、在17. 78min,時出現(xiàn)峰面積為1. 65%的離子流峰、在18. 47min時出現(xiàn)峰面積為2. 18%的離子流峰、在19. 54min時出現(xiàn)峰面積為5. 79%的離子流峰、在23. 18min時出現(xiàn)峰面積為 7.57%的離子流峰或者在24. 65min時出現(xiàn)峰面積為2. 39%的離子流峰；說明固相合成胸腺肽α I的20肽階段中含有缺失肽；如果在15.1lmin時出現(xiàn)峰面積為1. 46%的離子流峰或在16. 12min出現(xiàn)峰面積為2. 18%的離子流峰，則說明固相合成胸腺肽α I的20肽階段中含有非肽雜質(zhì)。本專利技術(shù)所述的胸腺肽α I的20肽的氨基酸序列為SEQ ID No.1所示。所述的梯度洗脫優(yōu)選為用O.1 %甲酸/乙腈梯度洗脫，流速為0.8ml/min，梯度為0_5min，0. 1% 甲酸 / 乙腈=97/3 ;5_35min，0. 1% 甲酸 / 乙腈=75/25。本專利技術(shù)方法中LC/MS聯(lián)用儀中的LC釆用Agilent 1200自動進樣，Waters XterraRP18分析柱的規(guī)格為5 μ m，3. O X 150mm ;LC/MS聯(lián)用儀中的MS釆用Bruker SolatixFT-1CR-MS，離子流檢測器。本專利技術(shù)進一步提供了固相合成胸腺肽α I的20肽階段的缺失肽譜，其氨基酸序列分別為 SEQ ID No. 2^SEQ ID No. 3、SEQ ID No.4、SEQ ID No. 5、SEQ ID No.6、SEQ ID No. 7或 SEQ ID No. 8 所示；本專利技術(shù)所提供的缺失肽譜或非肽雜質(zhì)作為胸腺肽α I固相合成中的質(zhì)量控制物，應(yīng)用于提高固相合成胸腺肽α I的質(zhì)量或純度。本專利技術(shù)方法可以準確、靈敏的鑒別出固相合成胸腺肽α I的20肽階段是否含有缺失肽或非肽雜質(zhì)，可以有效地保障和控制胸腺肽α I的質(zhì)量，在制備高純度固相合成胸腺肽α I中有重要應(yīng)用價值。附圖說明圖1 胸腺妝 α I 的二十妝片段 Ser-Glu-1le-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn 的離子流。圖2 胸腺妝 α I 的二十妝片段 Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn 的質(zhì)譜。 圖3非肽雜質(zhì)的質(zhì)譜。圖4非肽雜質(zhì)的質(zhì)譜。圖5 胸腺肽 ct I 的二十肽片段缺失肽 Ser-Glu-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn 和 Ser-Glu-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn 的質(zhì)譜。圖6 胸腺肽 α I 的二十肽片段缺失肽 Ser-Glu-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn 的質(zhì)譜。圖7 胸腺肽 ct I 的二十肽片段缺失肽 Ser-1le-Thr-Thr-Lys-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn 的質(zhì)譜圖8 胸腺肽 α I 的二十肽片段缺失肽 Ser-1le-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn 的質(zhì)譜。圖9 胸腺妝 α I 的二十妝片段缺失妝 Ser-Glu-1le-Thr-Thr-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn 的質(zhì)譜。圖10 胸腺肽 α I 的二十肽片段缺失肽 Ser-1le-Thr-Thr-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn 的質(zhì)譜圖11F3CC0-Ser-Glu_lIe-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn 的質(zhì)譜。具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本專利技術(shù)，本專利技術(shù)的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本專利技術(shù)的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本專利技術(shù)的精神和范圍下可以對本專利技術(shù)技術(shù)方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本專利技術(shù)的保護范圍內(nèi)。實施例1固相合成胸腺肽α I1.制備 Fmoc-Asn (Trt)-Wang Resin稱取IOg (3. lmmol) Wang Resin置于固相反應(yīng)合成柱中。加入60ml DCM溶脹樹脂lOmin，抽走DCM。用DMF洗樹脂三次，每次50ml，吹氣兩分鐘，抽走溶劑。于磨口三角瓶中稱取 5. 5g(9. 3mmol)Fmoc-Asn(Trt)和1. 38g(10. 23本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
一種檢測固相合成胸腺肽α1的20肽階段是否含有缺失肽或非肽雜質(zhì)的方法，包括以下步驟：將固相合成胸腺肽α1過程中的20肽采用LC/MS聯(lián)用儀進行梯度洗脫獲取離子流譜；如果所獲取的離子流譜在16.69min時出現(xiàn)峰面積為2.27％的離子流峰、在17.78min，時出現(xiàn)峰面積為1.65％的離子流峰、在18.47min時出現(xiàn)峰面積為2.18％的離子流峰、在19.54min時出現(xiàn)峰面積為5.79％的離子流峰、在23.18min時出現(xiàn)峰面積為7.57％的離子流峰或者在24.65min時出現(xiàn)峰面積為2.39％的離子流峰；說明固相合成胸腺肽α1的20肽階段中含有缺失肽；如果在15.11min時出現(xiàn)峰面積為1.46％的離子流峰或在16.12min出現(xiàn)峰面積為2.18％的離子流峰，則說明固相合成胸腺肽α1的20肽階段中含有非肽雜質(zhì)。
【技術(shù)特征摘要】
1.一種檢測固相合成胸腺肽a I的20肽階段是否含有缺失肽或非肽雜質(zhì)的方法，包括以下步驟將固相合成胸腺肽a I過程中的20肽采用LC/MS聯(lián)用儀進行梯度洗脫獲取離子流譜；如果所獲取的離子流譜在16. 69min時出現(xiàn)峰面積為2. 27%的離子流峰、在17. 78min,時出現(xiàn)峰面積為1. 65%的離子流峰、在18. 47min時出現(xiàn)峰面積為2. 18%的離子流峰、在19. 54min時出現(xiàn)峰面積為5. 79%的離子流峰、在23. 18min時出現(xiàn)峰面積為7.57%的離子流峰或者在24. 65min時出現(xiàn)峰面積為2. 39%的離子流峰；說明固相合成胸腺肽a I的20肽階段中含有缺失肽；如果在15.1lmin時出現(xiàn)峰面積為1. 46%的離子流峰或在16. 12min出現(xiàn)峰面積為2. 18%的離子流峰，則說明固相合成胸腺肽a I的20肽階段中含有非肽雜質(zhì)。2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的胸腺肽aI的20肽的氨基酸序列為 SEQ ID No.1 所示。3.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的梯度洗脫為用0.1 %甲酸/乙腈梯度洗脫，流速為0. 8ml/min,梯度為0-5min,0. 1%甲酸/乙腈=97/3 ；5-35min,...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：朱正兵，彭濤，王玲，張金花，
申請(專利權(quán))人：海南合瑞制藥股份有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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