一種可抑制病毒粒子釋放的蛋白，其編碼序列及在抑制逆轉錄病毒從細胞釋放中的應用制造技術

本發明專利技術公開了一種可抑制逆轉錄病毒粒子釋放的蛋白，其編碼序列及在抑制病毒從細胞釋放中的應用。本發明專利技術研究了該蛋白與馬傳染性貧血病毒（EIAV）、人免疫缺陷病毒（HIV-1）及猴免疫缺陷病毒（SIV）的相互作用關系，并確定他們相互作用的關鍵位點。本發明專利技術通過分子克隆技術，獲得了該蛋白基因和EIAV病毒樣顆粒的真核表達載體，經測序分析，克隆的該蛋白基因與該基因的預測序列的同源性為99%，相對應的氨基酸序列同源率為94.0%。該蛋白具有限制人免疫缺陷病毒1型、馬傳染性貧血病毒、以及猴免疫缺陷病毒病毒粒子從細胞釋放的能力，進一步的研究發現，EIAV的env蛋白能夠拮抗該蛋白對病毒的限制作用。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種可抑制病毒粒子釋放的蛋白，其編碼序列及在抑制逆轉錄病毒粒子從細胞釋放中的應用，特別涉及一種馬tetherin蛋白，其編碼序列及在抑制EIAV、HIV以及SIV從細胞釋放中的應用，屬于生物

技術介紹
機體內存在一些先天的免疫因子，這些因子可以起到控制病毒蔓延和防止病毒跨種間傳播的作用，被稱為“宿主限制因子”，參與先天性免疫反應，干擾病毒生命周期的不同階段。在人免疫缺陷病毒研究中發現，宿主細胞天然存在若干種屏障，對病毒的侵入、復制和出芽存在限制作用。目前有四大類限制因子:APOBEC (可誘導前病毒DNA產生致命的超級突變)、Trim5a (可特異性與剛進入細胞的病毒核衣殼蛋白結合，從而阻止病毒的脫殼和逆轉錄)、Tetherin (限制逆轉錄病毒釋放)、SAMHDl (阻礙逆轉錄病毒cDNA的合成，干擾病毒感染)。這些限制因子可有效地限制逆轉錄病毒感染，是宿主抵抗病毒感染的一個重要防御屏障。 1994年人們首次發現BST-2表達在人的漿細胞系、骨髓間質細胞和B細胞的表面，并推測該蛋白在B細胞的發育過程中發揮作用。2006年，研究人員證實BST-2是卡波西肉瘤相關性抱疫病毒(Kaposi’ s sarcoma-associated herpesvirus,KSHV)K5 蛋白(又稱 MIR2)的一個靶點，由此推測BST-2很可能與宿主抗病毒的防御機制有關。2008年這一抗病毒活性得到證實，它可以抑制Vpu缺陷的HIV-1病毒的釋放，重新命名為tetherin。Tetherin (BST2/CD317)是一種由干擾素誘導產生的抗病毒分子，它能夠抑制感染哺乳動物的多種衣殼病毒粒子從感染細胞中釋放。所有這些病毒共同具有的結構——病毒外膜，是tetherin作用的祀點。Tetherin通常只在類楽；樹突狀細胞上、部分癌細胞、終末分化成熟的B細胞和骨髓間質細胞中高效表達，但是tetherin也可以受I型干擾素(IFN-1)的誘導而表達。人體感染HIV-1病毒后，病毒粒子與樹突狀細胞(IFN的主要生成細胞)上的CD4受體結合，經內吞作用進入細胞漿，內涵體中的病毒核酸與TLR7/9結合，啟動信號傳導通路，誘導IFN-1 (包括IFNa、IFN^和IFNco三種形式)的表達。IFN-1可以誘導上百種不同基因的表達，并活化天然殺傷性細胞、骨髓樹突細胞、T細胞、B細胞和巨噬細胞。IFN-a和IFN-β與它們相應受體結合，通過JAK/STAT信號途徑誘導感染病毒的細胞中tetherin的表達。誘導產生的tetherin首先遷移到內質網上,然后通過COPI1-coated泡狀體運送到高爾基體的區室中，最終到達漿膜，同時利用胞質尾區保守的酪氨酸基團與AP2銜接蛋白復合物結合，在網格蛋白介導的內吞作用下進入包涵體，并在高爾基體和細胞表面之間循環往返。為了防止促炎細胞因子產生過剩，造成免疫亢奮，還有一個負反饋調節機制，即tetherin與漿細胞樹突狀細胞上的TLR7結合，抑制IFN-1和其他促炎細胞因子的表達。當新生的病毒出芽或釋放時，Tethein —端或兩端的膜錨定區可插入到病毒的衣殼中，進而將病毒錨定在細胞膜的表面，在細胞的內吞作用下，利用溶酶體降解病毒粒子。在長期進化過程中，病毒往往通過自身編碼的蛋白來抑制Tetherin的活性，從而形成了特定的逃逸機制。例如，人免疫缺陷病毒(HIV-1)的Vpu及猴免疫缺陷病毒(SIV)的Nef蛋白可拮抗tetherin的限制作用。然而適應一種宿主的病毒只能對抗該宿主的tetherin的限制作用，對異種動物tetherin的限制不具有對抗作用。因此,tetherin被認為在防止病毒跨種間傳播方面具有重要作用。Vpu蛋白是HIV-1病毒的輔助調節蛋白之一，是一個大小為16kDa的跨膜蛋白，可直接與Tetherin的跨膜區相互作用。這種相互作用具有高度的特異性，tetherin跨膜區位點的突變可使其克服Vpu的拮抗作用。Vpu弓I起宿主細胞表面tetherin水平下降、也會使細胞中tetherin總量減少。Vpu在高爾基體反面的網狀結構或早期內涵體上祀定tetherin,通過β-TrCP (嵌合泛素連接酶)-依賴機制,經蛋白酶或溶酶體途徑降解tetherin,從而將tetherin的作用沉默。然而，Vpu上的結合位點β-TrCP的突變并不能完全干擾Vpu克服tetherin的作用；而tetherin含量下調也并不完全取決于Vpu的中和作用。所以，tetherin在細胞表面表達減少、在細胞內被降解或者沉默的確切機制，以及Vpu依賴性的病毒釋放增強機制中各因子的作用還需要進一步的研究。大多數靈長類慢病毒并不含有Vpu蛋白，有些慢病毒(例如分別感染烏白眉猴sooty mangabeys、短尾猴 macaques、Syke 猴、Syke，s monkeys 和非洲綠猴 African greenmonkeys的SIVsmm、SIVmac、SIVsyk和SIVagm病毒)利用自身編碼的Nef蛋白抵抗tetherin的抑制作用。另外，感染黑猩猩chimpanzees和大猩猩gorillaz的SIVcpz和SIVgor病毒是HIV-1的起源，也含有Vpu蛋白， 但是卻應用Nef蛋白阻斷tetherin的作用。Nef是病毒在體內有效復制的關鍵蛋白，它可以在宿主細胞中調控細胞的運輸、信號轉導和基因的表達。Nef是如何拮抗tetherin的作用目前還不清楚，但是Nef可作為銜接蛋白(adaptorprotein),與胞漿中的⑶4、⑶28和MHC-1相互作用，使它們的表達量降低。Nef還可以錨定Tetherin的胞質尾區，降低tetherin在宿主細胞表面的表達。如果在Nef上做某些突變，可阻斷它對tetherin的作用，同時也可以消除它對⑶4表達量下調的作用。Tetherin抗病毒活性的發現為宿主防御機制研究方面開辟了一個新的領域。目前，人們對病毒與宿主之間相互作用的復雜機制的了解還剛剛開始，仍有一些宿主限制因子沒有發現，受IFN-1誘導產生因子的功能也還未可知。是否不能誘導IFN-1反應的病毒就不需要有自身編碼的拮抗基因的存在還不清楚。Tetherin拮抗物對于病毒復制方面的重要意義還需要進一步的研究。進一步的研究不僅可以揭示病毒與其宿主相互斗爭的分子機制，而且還可以引入基因干預的思路來治療HIV和其他病毒
技術實現思路
本專利技術的目的在于通過分子克隆技術，構建馬tetherin蛋白基因和EIAV感染性克隆的真核表達載體，研究馬tetherin與EIAV的相互作用關系，并確定他們相互作用的關鍵位點。為了達到以上目的本專利技術采用了以下技術方案:本專利技術利用普通PCR從馬血中擴增馬tetherin基因，應用克隆技術構建該基因及其突變基因(delCT、delGP1、N51A、N78A)的重組質粒，利用融合PCR技術和克隆技術構建EIAVaenv的Gp2、Gp3包裝質粒；通過脂質體Lipofectamine2000在驢皮膚細胞上轉染馬tetherin重組質粒，再感染EIAV病毒，或者在Hela或者HEK293T細胞上通過磷酸鈣法共轉染目的基因和包裝質粒，收集細胞裂解液和培養液上清，進行West本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種可抑制逆轉錄病毒粒子釋放的蛋白，為馬tetherin蛋白，其特征在于具有SEQ?ID?NO.1所示的氨基酸序列。

【技術特征摘要】
1.一種可抑制逆轉錄病毒粒子釋放的蛋白，為馬tetherin蛋白，其特征在于具有SEQID N0.1所示的氨基酸序列。2.編碼權利要求1所述蛋白的核苷酸序列。3.如權利要求2所述的核苷酸序列，其特征在于所述的核苷酸序列如SEQIDN0.2所/Jn ο4.一種表達載體,其特征在于含有權利要求2或3所述的核苷酸序列。5.一種宿主細胞，其特征在于含有權利要求4所述的表達載體。6.權利要求1所述的蛋白在制備抑制逆轉錄病毒從細胞釋放的藥物中的應用，所述的逆轉錄病毒包括馬傳染性...

【專利技術屬性】
技術研發人員：王曉鈞，胡哲，
申請(專利權)人：中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所，
類型：發明
國別省市：