本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種端粒位置效應(yīng)細(xì)胞模型及其用途。具體的，本發(fā)明專利技術(shù)提供一種端粒位置效應(yīng)質(zhì)粒，它是在pCMV-GFP載體的GFP基因或pCMV-Luciferase載體的Luciferase基因的下游插入如SEQIDNO.1所示的T2AG3序列構(gòu)建得到的；另提供了含有上述端粒位置效應(yīng)質(zhì)粒的細(xì)胞模型；還提供了上述細(xì)胞模型在高通量篩選影響端粒功能的藥物中的用途。運(yùn)用本發(fā)明專利技術(shù)的細(xì)胞模型可以高通量篩選對(duì)端粒功能有影響的藥物，尤其是篩選抑制端粒位置效應(yīng)的藥物，彌補(bǔ)了高通量篩選影響端粒功能藥物方面的空白，為進(jìn)一步開發(fā)以端粒為靶點(diǎn)的涉及腫瘤、衰老的臨床藥物打下基礎(chǔ)。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及用于篩選影響端粒功能的藥物或化合物的細(xì)胞模型，具體地說，是一種端粒位置效應(yīng)細(xì)胞模型及其用途。
技術(shù)介紹
端粒是染色體末端具有重復(fù)序列的特殊結(jié)構(gòu)，它是由簡單的DNA高度重復(fù)序列組成的，染色體末端沿著5’到3’方向的鏈富含GT。在酵母和人體中，端粒序列分別為C1-3A/TG1-3和TTAGGG/CCCTAA，并有許多端粒蛋白與端粒結(jié)合。端粒的主要功能有:第一，保護(hù)染色體不被核酸酶降解；第二，防止染色體相互融合；第三，為端粒酶提供底物，解決DNA復(fù)制的末端隱縮，保證染色體的完全復(fù)制。端粒、著絲粒和復(fù)制原點(diǎn)是染色體保持完整和穩(wěn)定的三大要素。同時(shí)，端粒又是基因調(diào)控的特殊位點(diǎn)，常可抑制位于端粒附近基因的轉(zhuǎn)錄活性，沉默它附近基因的表·達(dá)，并與端粒長度有關(guān)，稱之為端粒位置效應(yīng)(Telomere PositionEffect，TPE)，而正常細(xì)胞端粒隨細(xì)胞分裂逐漸縮短，端粒附近沉默的基因是重新表達(dá)的。已有研究表明證實(shí)TPE與細(xì)胞老化和腫瘤存在密切聯(lián)系。中國期刊《第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)》，2005年4月，第27卷第8期，刊出的論文“胃癌細(xì)胞中端粒位置效應(yīng)研究”，作者將pTET-OFF調(diào)節(jié)質(zhì)粒和攜帶熒光素酶報(bào)道基因的pTRE2-Hyg-Luc if erase反應(yīng)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞SGC7901，經(jīng)強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)24h后檢測報(bào)道基因活性，觀察強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)的抑制反應(yīng)。然后將插入有端粒片段的熒光素酶報(bào)道質(zhì)粒PBX質(zhì)粒和對(duì)照質(zhì)粒pBX-ntf (noteloemere fragment)分別與pTET_0FF調(diào)節(jié)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞,在強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)下,檢測報(bào)道基因活性的改變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)共轉(zhuǎn)染pTET-OFF和pTRE-Hyg-Luc if erase質(zhì)粒的SGC7901細(xì)胞在強(qiáng)力霉素作用下熒光素酶報(bào)道基因的活性逐漸降低。強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)分別共轉(zhuǎn)染有pTET-OFF和pBX質(zhì)粒或pTET-OFF和pBX-ntf的細(xì)胞時(shí)，前者熒光素酶活性較后者降低4倍。得出結(jié)論:轉(zhuǎn)染TET-OFF基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)的胃癌細(xì)胞SGC7901受強(qiáng)力霉素的誘導(dǎo)抑制；轉(zhuǎn)染入胃癌細(xì)胞中的端粒片段降低了存在它附近熒光素酶報(bào)道基因的表達(dá)水平，也即TPE引起基因的不穩(wěn)定。中國期刊《細(xì)胞生物學(xué)雜志》，2004，26:513_515，刊出的論文“端粒位置效應(yīng)與人類衰老”表明TPE可能對(duì)細(xì)胞生長停止、以及衰老發(fā)生時(shí)等許多隨端粒縮短密切相關(guān)基因的程序性表達(dá)產(chǎn)生重要作用。總之，端粒在細(xì)胞老化和腫瘤中起著重要作用，成為抗衰老和抗腫瘤治療的重要靶點(diǎn)。篩選對(duì)端粒功能有影響的藥物，進(jìn)一步開發(fā)以端粒為靶點(diǎn)的臨床藥物對(duì)于腫瘤或其他相關(guān)疾病的治療以及延緩衰老具有重要意義。但是目前并沒有方法可以高通量篩選影響端粒功能的藥物，尤其是影響TPE的藥物。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種端粒位置效應(yīng)質(zhì)粒。本專利技術(shù)的再一的目的是，提供上述端粒位置效應(yīng)質(zhì)粒的用途。本專利技術(shù)的另一的目的是，提供一種端粒位置效應(yīng)細(xì)胞模型。本專利技術(shù)的第四個(gè)目的是，提供端粒位置效應(yīng)細(xì)胞模型的用途。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)采取的技術(shù)方案是: 一種端粒位置效應(yīng)質(zhì)粒，它是在pCMV-GFP載體的GFP基因或pCMV-Luciferase載體的Lucif erase基因的下游插入如SEQ ID N0.1所示的T2AG3序列構(gòu)建得到的；所述的pCMV-Luciferase載體是用Luciferase基因片段置換pCMV_GFP載體的GFP基因片段構(gòu)建得到的。其中，所述的端粒位置效應(yīng)質(zhì)粒的具體構(gòu)建方法是:使用NotI和PvuI雙酶切pSXneo270 (T2AG3)質(zhì)粒，回收T2AG3序列片段；使用NotI酶切pCMV-Luc if erase載體或pCMV-GFP載體，回收大片段；再使用連接酶連接上述T2AG3序列片段和大片段，并用補(bǔ)齊酶補(bǔ)齊一端酶切位點(diǎn)不匹配導(dǎo)致的堿基缺損；最后經(jīng)轉(zhuǎn)化，篩選，一代測序獲得正確連接的克隆。為實(shí)現(xiàn)上述第二個(gè)目的，本專利技術(shù)采取的技術(shù)方案是: 如上所述的端粒位置效應(yīng)質(zhì)粒在建立端粒位置效應(yīng)細(xì)胞模型中的用途； 如上所述的端粒位置效應(yīng)質(zhì)粒在高通量篩選抑制端粒位置效應(yīng)的藥物中的用途。為實(shí)現(xiàn)上述第三個(gè)目的，本專利技術(shù)采取的技術(shù)方案是: 一種端粒位置效應(yīng)細(xì)胞模型，它是含有如上所述的端粒位置效應(yīng)質(zhì)粒的細(xì)胞； 其中，所述的端粒位置效應(yīng)細(xì)胞模型可以是含有如上所述的端粒位置效應(yīng)質(zhì)粒的C33A宮頸癌細(xì)胞。為實(shí)現(xiàn)上述第四個(gè)目的，本專利技術(shù)采取的技術(shù)方案是: 如上所述的端粒位置效應(yīng)細(xì)胞模型在高通量篩選影響端粒功能的藥物中的用途；如上所述的端粒位置效應(yīng)細(xì)胞模型在高通量篩選增強(qiáng)或抑制端粒位置效應(yīng)的藥物中的用途。本專利技術(shù)優(yōu)點(diǎn)在于: 本專利技術(shù)成功構(gòu)建了端粒位置效應(yīng)質(zhì)粒和細(xì)胞模型，運(yùn)用該細(xì)胞模型可以高通量篩選對(duì)端粒功能有影響的藥物，尤其是篩選抑制端粒位置效應(yīng)的藥物，彌補(bǔ)了高通量篩選影響端粒功能藥物方面的空白，為進(jìn)一步開發(fā)以端粒為祀點(diǎn)的涉及腫瘤、衰老的臨床藥物打下基礎(chǔ)。附圖說明附圖1 是 PGL3_Luciferase 載體圖譜。附圖2是pCMV-GFP載體圖譜。附圖3是pCMV質(zhì)粒、Luciferase-TPE質(zhì)粒、GFP-TPE質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)示意圖。其中，pCMV為對(duì)照質(zhì)粒；TPE-Telo為Luciferase-TPE質(zhì)粒和GFP-TPE質(zhì)粒，其可通過TPE作用影響報(bào)告基因Luciferase或GFP的表達(dá)。附圖4是對(duì)照C33A細(xì)胞株和Luciferase-ΤΡΕ細(xì)胞模型的Luciferase檢測結(jié)果。其中，三角形代表對(duì)照細(xì)胞株，正方形代表Luciferase-TPE細(xì)胞模型；橫坐標(biāo)為不同時(shí)間段，縱坐標(biāo)為Luciferase的化 學(xué)發(fā)光強(qiáng)度。附圖5是運(yùn)用Luciferase-ΤΡΕ細(xì)胞模型高通量自動(dòng)篩選Prestwick Chemicals藥庫結(jié)果。其中，橫坐標(biāo)是被篩選的藥物名稱，縱坐標(biāo)是Luciferase表達(dá)量；pCMV_24hr表示pCMV對(duì)照組經(jīng)藥物處理24h，pCMVTelo-24hr表示Luciferase-ΤΡΕ細(xì)胞模型經(jīng)藥物處理24h，pCMV-72hr 表示 pCMV 對(duì)照組經(jīng)藥物處理 72h，pCMVTelo_72hr 表示 Luciferase-ΤΡΕ 細(xì)胞經(jīng)藥物處理72h。附圖6是在GFP-TPE模型中，運(yùn)用GFP作為報(bào)告基因，用流式細(xì)胞儀檢測證實(shí)Acacetin和Chrysin作用后GFP表達(dá)量升高，提示該藥物對(duì)端粒的TPE作用有影響。附圖7A、7B和7C是運(yùn)用分子生物學(xué)方法證實(shí)chrysin和acacetin對(duì)TPE的抑制作用的結(jié)果。圖7A為C33A腫瘤細(xì)胞經(jīng)Chrysin和Acacetin處理后，表現(xiàn)出經(jīng)典的TIF信號(hào)(Telomere dysfunction Induced Foci,即端粒受DNA損傷通路攻擊的特異性信號(hào))明顯增多；圖7B為MR90正常成纖維細(xì)胞經(jīng)Chrysin和Acacetin處理后，表現(xiàn)出經(jīng)典的TIF信號(hào)明顯增多。其中，圖7A、圖7B中上端的圖片為代表性TIF信號(hào)圖，下端的柱狀圖是根據(jù)TIF信號(hào)圖定量計(jì)算得到的TIF信號(hào)值。圖7C為Chrysin和Acacetin處理后引起端粒失功能特異性的染色體末端畸變等表型(C左)和定量分析結(jié)果(C右)。具體實(shí)施方式 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種端粒位置效應(yīng)質(zhì)粒，其特征在于，它是在pCMV?GFP載體的GFP基因或pCMV?Luciferase載體的Luciferase基因的下游插入如SEQ?ID?NO.1所示的T2AG3序列構(gòu)建得到的；所述的pCMV?Luciferase載體是用Luciferase基因片段置換pCMV?GFP載體的GFP基因片段構(gòu)建得到的。
【技術(shù)特征摘要】
1.一種端粒位置效應(yīng)質(zhì)粒，其特征在于，它是在PCMV-GFP載體的GFP基因或pCMV-Luciferase載體的Luciferase基因的下游插入如SEQ ID N0.1所不的T2AG3序列構(gòu)建得到的；所述的pCMV-Luciferase載體是用Luciferase基因片段置換pCMV_GFP載體的GFP基因片段構(gòu)建得到的。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的端粒位置效應(yīng)質(zhì)粒，其特征在于，所述的端粒位置效應(yīng)質(zhì)粒的具體構(gòu)建方法是:使用NotI和PvuI雙酶切pSXneo270 (T2AG3)質(zhì)粒，回收T2AG3序列片段；使用NotI酶切pCMV-Luciferase載體或pCMV_GFP載體，回收大片段；再使用連接酶連接上述T2AG3序列片段和大片段，...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：葉靜，陸一鳴，魏波華，應(yīng)亦林，梁慧欣，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院，
類型：發(fā)明
國別省市：
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