本發明專利技術公開了一種快速鑒別診斷不同血清型禽白血病病毒PCR-HRM分析方法的建立。本發明專利技術的通用引物，簡并性好，對禽白血病病毒A、B、C、D和E亞型均有很好地的擴增性，有助于提高PCR的效率，減少病毒鑒別分型的時間；本發明專利技術的特異性引物，特異性好，可以特異性擴增出J亞型。對使用本發明專利技術引物得到的擴增產物進行HRM分析，與已知亞型的標準HRM曲線進行比對，就可以準確、快速、高通量地進行禽白血病病毒分型，特別是可以快速、準確地區分內源型和外源型禽白血病病毒。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種病毒研究方法，特別涉及一種禽白血病病毒的研究方法。
技術介紹
禽白血病(Avian Leukosis, AL)是由禽白血病/肉瘤病毒群病毒(AvianLeukosis / sarcoma virus,AL / SV)引起的禽類多種腫瘤性疾病的總稱。根據臨床癥狀可分為淋巴細胞性白血病、成紅細胞性白血病、成髓細胞白血病、髓細胞樣白血病、結締組織性腫瘤和骨硬化病等，其中以淋巴白血病最為常見。禽白血病病毒可分為A、B、C、D、E和J共6個亞型。其中，A、B、C、D和J亞型為外源性病毒，而C、D亞型在自然狀態下很少存在，E亞型病毒為極普遍存在的內源性病毒。在我國，外源性禽白血病病毒主要為J亞型，A、B亞型報道較少。至今，人類對禽白血病的防治幾乎仍無計可施，世界各國控制禽白血病的主要方法是通過早期反復多次的病原檢測，淘汰陽性雞(A、B、J亞型)，從而凈化種群達到局部消滅本病的目的。因此，及時準確的對禽白血病病毒進行診斷及分型，特別是區分其內源型和外源型，有助于確定該病毒的流行趨勢，進而采取相應的措施加以控制。目前，禽白血病病毒鑒定及血清分型的方法有許多種，包括病毒的分離與鑒定、ELISA方法和PCR技術等等，但這些方法均難以快速有效地對病毒進行分型。究其原因，主要是檢測技術的敏感性、準確性及檢測操作復雜化(內源性病毒的干擾需經細胞培養才能消除，從而導致工作量巨大)影響了疫病的檢測及凈化。現有的檢測方法介紹如下: 病毒的分尚與鑒定 病毒分離鑒定是診斷禽白血病最為有效、可靠的技術。用于病毒分離的理想材料為血漿、糞便、蛋清、胚胎、精液、和羽髓。將被檢材料經適當處理后，接種于DF-1細胞。由于只有外源性ALV在DF-1細胞上生長，既可用P27 ELISA試劑盒來檢測有無病毒生長。而內源性ALV不能在DF-1細胞上生長，從而可區分內源和外源病毒的感染。病毒分離檢測技術最大的缺點是費時、昂貴，不易對大量樣品進行檢測。即使在最適宜條件下，從取樣到出結果至少需要10天。此外，即使病毒分離技術可以方便的應用于診斷雞只的感染，也很難確保雞體內不存在有潛伏感染的病毒，更不能排除雞只發生再感染的可能。酶聯免疫吸附試驗(ELISA) ELISA檢測技術的優點是廉價、快速，適用于包括蛋清、血清、胎糞、泄殖腔棉拭子等多種樣品的檢測。1979年，Smith用兔抗禽白血病衣殼蛋白p27建立了檢測ALV抗原的雙抗夾心ELISA法。目前，ALV抗原診斷試劑盒已實現商品化。這種檢測技術最大的缺點是檢測結果不時出現假陽性， 因為雙抗夾心ELISA只檢測該病毒的一種蛋白質:p27，利用該技術檢測出的陽性結果僅能說明待檢樣品中含有P27，而p27是禽白血病的群特異性抗原，在內源性病毒和外源性病毒中均屬保守的一種蛋白質，利用雙抗夾心ELISA所檢測出的陽性結果并不能證實這種蛋白來源于外源性病毒。因此，在檢測外源性病毒時常出現一定數量的假陽性結果。雖然市場上已經有用于檢測ALV-AB亞群抗體和ALV-J亞群抗體的ELISA試劑盒出售，但是由于ALV-J亞群病毒的抗原變異率很高，因此對于某株J亞群病毒具有結合作用的抗體并不能與所有ALV-J的其它分離株結合。因此，在使用ELISA方法進行感染診斷時，也容易出現假陰性結果，影響其準確性。此外，禽白血病的病毒血癥與抗體產生不同步，ELISA只能檢測ALV的抗體水平，即使檢測是陽性樣品，只能說明曾經感染過ALV，不能判斷雞群中現在是否還存在ALV的感染。聚合酶鏈式反應(PCR) 直接從病變組織、腫瘤或細胞提取物中提取病毒RNA或者前病毒DNA，利用PCR的方法來檢測ALV已經成為實驗室診斷的常規手段，可以區分鑒別不同亞群的ALV。絕大部分設計引物的區域位于env和LTR序列。現已有一些特異性的引物可以檢測絕大部分的ALV分離株，也有用于檢測細胞培養中感染的內源性E亞群病毒。PCR檢測技術雖然特異性高，但是該方法是根據PCR擴增產物的電泳條帶大小來分析不同亞群，所以該方法目前 還做不到高通量的檢測任務，而亞群特異性探針價格昂貴也限制了熒光定量PCR檢測方法的實際應用。因此，目前急需一種操作相對簡易、檢測結果可靠且檢測成本低廉的禽白血病快速分型方法用于規模化種雞廠禽白血病病毒的分型研究。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供2對用于禽白血病病毒分型的引物。本專利技術的另一個目的在于提供一種禽白血病病毒分型鑒別方法。本專利技術所采取的技術方案是: 一種鑒別不同亞型禽白血病病毒的引物，包括兩對引物，分別為通用引用Pl和P2，以及J亞型特異引物P3和P4，其中:Pl:CCTTGCTGCCAACGACACTTA (SEQ ID NO:1)P2:GAACCTARCAGYTGTAGTC (SEQ ID NO:2)P3:CAGGAAACGTGTGGGTCACC (SEQ ID NO:3)P4:TTATTGGACTTACCATCG (SEQ ID NO:4)。一種快速鑒別不同亞型禽白血病病毒的方法，包括如下步驟: 1)從樣品中提取病毒RNA，并反轉錄為cDNA； 2)以cDNA為模板，分別加入上述擴增引物對和熒光飽和染料進行擴增； 3)對擴增產物直接進行HRM分析，確定病毒的亞型； 其中，所使用的引物為上述的引物Pl P4。進一步的，通用引物擴增的反應體系為: ddH20 2.4 μ IPremix Taq 5 μ I上游引物(PD 0.4μ I下游引物(Ρ2) 0.4μ I模板0.8 μ I LC green 染料 I μ I Total 10 μ 1進一步的，J亞型特異引物擴增的反應體系為: ddH20 2.4 μ IPremix Taq 5 μ I上游引物(Ρ3) 0.4μ I下游引物(Ρ4) 0.4μ I模板0.8 μ I LC green 染料 I μ I Total 10 μ 1進一步的，上述兩個擴增的反應程序為: 94°C預變性5min ； 94°C變性30s，55。。退火30s，72。。延伸30s ;循環35次； 72°C終延伸8min。本專利技術的有益效果是: 本專利技術的通用引物,簡并性好,對禽白血病病毒A、B、C、D和E亞型均有很好地的擴增性，有助于提高PCR的效率，減少病毒鑒別分型的時間；本專利技術的特異性引物，特異性好，可以特異性擴增出J亞型。對使用本專利技術引物得到的擴增產物進行HRM分析，與已知亞型的標準HRM曲線進行比對(利用構建的標準質粒作圖)，就可以準確、快速、高通量地進行禽白血病病毒分型，特別是可以快速、準確地區分內源型和外源型禽白血病病毒。本專利技術方法，具有如下優點: ￠:操作簡單:只需PCR反應之前加熒光飽和染料即可；::!::檢測速度快且高通量:5 10分鐘即可完成96/384孔板的PCR產物檢測，不需要病毒的細胞培養，極大縮短了檢測時間；:f:對病源物進行HRM分析，可直接反應當前感染狀態，有利于后續的流行病學研究。通過分析HRM熔解曲線形狀即可區分外源性和內源性ALV病毒，避免了由于群特異性ALV-P27抗原檢測而造成的假陽性。可對ALV分子進化進行動態監測。@費用低，不需要特異性探針，每個樣品的飽和染料成本為1.6 RMB ;,文;準確性高本文檔來自技高網...
【技術保護點】
鑒別不同亞型禽白血病病毒的引物，包括兩對引物，分別為通用引用引物P1和P2（擴增A、B、C、D和E亞型），以及J亞型特異引物P3和P4，其中：P1：CCTTGCTGCCAACGACACTTA（SEQ?ID?NO：1）P2：GAACCTARCAGYTGTAGTC（SEQ?ID?NO：2）P3：CAGGAAACGTGTGGGTCACC（SEQ?ID?NO：3）P4：TTATTGGACTTACCATCG（SEQ?ID?NO：4）。
【技術特征摘要】
1.鑒別不同亞型禽白血病病毒的引物，包括兩對引物，分別為通用引用引物Pl和P2(擴增A、B、C、D和E亞型)，以及J亞型特異引物P3和P4，其中:Pl:CCTTGCTGCCAACGACACTTA (SEQ ID NO:1)P2:GAACCTARCAGYTGTAGTC (SEQ ID NO:2)P3:CAGGAAACGTGTGGGTCACC (SEQ ID NO:3)P4:TTATTGGACTTACCATCG (SEQ ID NO:4)。2.一種快速鑒 別不同亞型禽白血病病毒的方法，包括如下步驟: 1)從樣品中提取病毒RNA，并反轉錄為cDNA； 2)以cDNA為模板，加入上述擴增引物對和熒光飽和染料進行擴增； 3)對擴增產物進行HRM分析，確定病毒的亞型； 其中，所使用的引物如權利要求1所述。3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于:通用引物...
【專利技術屬性】
技術研發人員：郭鵬舉，張建峰，張春紅，嘎利兵嘎，
申請(專利權)人：廣東省農業科學院動物衛生研究所，
類型：發明
國別省市：
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