重組人源細(xì)胞珠蛋白在制備治療脂肪肝藥物中的應(yīng)用制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了重組人源細(xì)胞珠蛋白在制備治療脂肪肝藥物中的應(yīng)用。通過(guò)建立酒精肝大鼠模型，按rhCYGB3mg/Kg的劑量皮下注射，進(jìn)行治療，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，重組人源細(xì)胞珠蛋白藥物無(wú)毒性，與模型對(duì)照組相比，rhCYGB治療組有顯著的改善，其脂肪滴較模型組明顯減少，肝索排列整齊。還原型谷胱甘肽治療組仍有明顯脂肪變性，肝細(xì)胞輕度腫脹。rhCYGB治療酒精性脂肪肝比還原型谷胱甘肽藥效更好。采用重組人源細(xì)胞珠蛋白治療脂肪肝，特別是酒精性脂肪肝具有低毒、安全、有效的優(yōu)點(diǎn)。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及ー種蛋白的新用途，特別涉及ー種細(xì)胞珠蛋白的新用途。
技術(shù)介紹
飲酒是人類文明盛傳已久的習(xí)慣之一，適量的飲酒對(duì)健康并無(wú)明顯損害，甚至對(duì)冠心病等還有一定的預(yù)防作用。但是酒精濫用和酒精依賴影響了全球數(shù)百萬(wàn)人ロ，對(duì)社會(huì)和人類健康產(chǎn)生了許多不良影響。根據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)告全球范圍內(nèi)有20億的酒精消耗，有約7 630萬(wàn)人被診斷為酒精濫用，毎年死于酒精濫用的人數(shù)已達(dá)到3.2%，有4.0%的人被疾病困擾。目前，在我國(guó)由于酒精所致肝損傷的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，酒精已成為繼病毒性肝炎后導(dǎo)致肝損害的第二大病因嚴(yán)重危害了人類健康。因此，正確認(rèn)識(shí)酒精性肝病，及時(shí)診斷和治療，具有重要意義。酒精性脂肪肝是 由于長(zhǎng)期大量飲酒導(dǎo)致的肝臟疾病，其發(fā)病機(jī)理存在多種假說(shuō)，有人認(rèn)為其是こ醇及其衍生物的代謝過(guò)程中直接或間接誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，氧化應(yīng)激、腸源性內(nèi)毒素、炎性介質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)失衡(尤其是蛋白質(zhì)ー熱量營(yíng)養(yǎng)不良)等多種因素相互作用的結(jié)果，也有人認(rèn)為酒精因素作為初次打擊，通過(guò)氧化應(yīng)激促使反應(yīng)性氧化物増加，而誘發(fā)肝臟脂肪聚集。在氧化應(yīng)激相關(guān)的脂質(zhì)過(guò)氧化及炎性細(xì)胞因子的作用下，使脂肪變的肝細(xì)胞發(fā)生第二次打擊，造成炎癥、壞死和纖維化，但是并未有定論。此外，由于酒精性脂肪肝是ー種慢性病，而現(xiàn)有的酒精性脂肪肝普遍采用高度數(shù)酒精灌胃，對(duì)動(dòng)物體的刺激大，同吋，灌胃對(duì)動(dòng)物的刺激大，導(dǎo)致動(dòng)物精神緊張，動(dòng)物的神經(jīng)系統(tǒng)及內(nèi)分泌系統(tǒng)受到一定影響，得到的動(dòng)物模型與真實(shí)發(fā)展而成的酒精性脂肪肝存在較大的區(qū)別，這也給酒精性脂肪肝的藥物篩選帶來(lái)了一定程度的影響。。酒精性脂肪肝的臨床癥狀為非特異性，可無(wú)癥狀，或有右上腹脹痛、食欲不振、乏力、體質(zhì)量減輕等。酒精性脂肪肝是ー種慢性病，一般認(rèn)為其危害不大，但是其可進(jìn)ー步發(fā)展為其他嚴(yán)重的肝病，影響人們的生命健康。酒精性脂肪肝的發(fā)生和發(fā)展存在種族、遺傳、性別、年齡等差異，治療效果也因人而異，未有成熟的治療方案。目前治療酒精性脂肪肝主要是通過(guò)戒酒及對(duì)癥的藥物治療，如營(yíng)養(yǎng)支持、降血脂、不飽和脂肪酸及磷脂類藥物治療等，但治療效果不佳，有ー些藥物的副作用明顯；也有用抗氧化劑和抗內(nèi)毒素治療的，但也不能獲得理想的效果，可能不能針對(duì)性清除激活的Kupffer細(xì)胞釋放的炎性因子及活性氧成分；中藥成分復(fù)雜，其有效成分難于確定，制備エ藝不夠穩(wěn)定，成品質(zhì)量難以控制。至今仍沒有有效且副作用小的治療方法，因此，開發(fā)真正有效防治酒精性脂肪肝的藥物，己經(jīng)是當(dāng)前迫切需要解決的問(wèn)題。細(xì)胞珠蛋白(cytoglobin)是人體固有的保護(hù)性蛋白，對(duì)機(jī)體無(wú)毒副作用。細(xì)胞珠蛋白最初由Kawada等在大鼠HSC中發(fā)現(xiàn)，其在硫代こ酰胺脅迫誘導(dǎo)的纖維化肝臟星狀細(xì)胞(HSC)中表達(dá)明顯増加，因而起初被命名為HSC激活相關(guān)蛋白(Stellate cellactivation-associated protein, STAP)。蛋白測(cè)序表明它屬于新的一類含血紅素的六配位蛋白(Hexacoordinate globin super-family),是哺乳動(dòng)物中四種球蛋白(Globin)之一。進(jìn)ー步的研究發(fā)現(xiàn)STAP不僅存在于HSC中，還普遍存在于人類多種器官組織以及腎臟和胰臟的類成纖維細(xì)胞中，因而將其統(tǒng)ー稱為細(xì)胞珠蛋白(Cytoglobin，Cygb).細(xì)胞珠蛋白由190個(gè)氨基酸殘基組成，分子量是21.4KD，定位于染色體17q25。目前的研究表明Cygb具有過(guò)氧化酶的作用，活性氧清除劑的作用及一氧化氮加雙氧酶功能，基因上具有保守的組織缺氧反應(yīng)元件(HRE)，其3’ UTR同時(shí)還含有組織缺氧誘導(dǎo)的mRNA穩(wěn)定信號(hào)(HIPBS)，可保證Cygb基因在組織缺氧時(shí)的表達(dá)和穩(wěn)定性。在各種應(yīng)激情況下如缺血、氧化應(yīng)激及纖維化吋，Cygb表達(dá)增加。與球蛋白家族的其他成員一祥，Cygb具有保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的損傷，體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)表明外源性過(guò)表達(dá)rhCygb可保護(hù)肝星狀細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷并且抑制其向纖維樣細(xì)胞分化。由于人類Cygb與大鼠Cygb在基因序列上具有97%的同源性，故本實(shí)驗(yàn)采用來(lái)源于人的Cygb的rhCygb蛋白進(jìn)行大鼠模型的治療實(shí)驗(yàn)。迄今未有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)人源珠蛋白具有改善或治療脂肪肝，特別是酒精性脂肪肝的功能。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的在于提供重組人源細(xì)胞珠蛋白在制備治療脂肪肝，特別是酒精性脂肪肝藥物中的應(yīng)用。本申請(qǐng)專利技術(shù)人通過(guò)建立酒精肝大鼠模型，按rhCYGB 3 mg/Kg的劑量皮下注射，進(jìn)行治療，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，重組人源細(xì)胞珠蛋白藥物無(wú)毒性，與模型對(duì)照組相比，rhCYGB治療組有顯著的改善，其脂肪滴較模型組明顯減少，肝索排列整齊。還原型谷胱甘肽治療組仍有明顯脂肪變性，肝細(xì)胞輕度腫脹。rhCYGB治療酒精性脂肪肝比還原型谷胱甘肽藥效更好。采用重組人源細(xì)胞珠蛋白治療脂肪肝，特別是酒精性脂肪肝具有低毒、安全、有效的優(yōu)點(diǎn)。附圖說(shuō)明圖1是rhCYGB誘導(dǎo)表達(dá)后的SDS-PAGE電泳 圖2是純化后的rhCYGB的SDS-PAGE電泳 圖3是造模30周后正常對(duì)照組與造模組大鼠肝臟組織HE染色結(jié)果 圖4是治療后各組大鼠肝臟組織HE染色結(jié)果。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)驗(yàn)，進(jìn)ー步說(shuō)明本專利技術(shù)。以上實(shí)驗(yàn)中，CYGB為細(xì)胞珠蛋白的縮寫，rhCYGB為重組人源細(xì)胞珠蛋白的縮寫。rhCYGB 的制備: rhCYGB的誘導(dǎo)表達(dá):將PET28a-rhCYGB-BL21 (DE3)菌株用Kan+的LB培養(yǎng)液培養(yǎng)過(guò)夜，次日按1:100比例轉(zhuǎn)入新鮮LB(Kan+)培養(yǎng)液中，當(dāng)OD6tltl達(dá)0.6時(shí)，加入IPTG至終濃度為Immol/L，37°C誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h收菌。經(jīng)12% SDS-PAGE檢測(cè)，電泳圖如圖1所示，圖中，A:低分子量蛋白Marker; B: PET28a-rhCygb_BL21 (DE3)菌株表達(dá)產(chǎn)物；C:陰性空載體菌株P(guān)ET28a-BL21(DE3)表達(dá)產(chǎn)物重組菌表達(dá)產(chǎn)物中在分子量約為21 kDa位置出現(xiàn)一條粗帶(圖1)。rhCYGB的純化:將誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白，經(jīng)裂解洗滌后，用分子篩G25復(fù)性和初歩純化，再經(jīng)親和層析柱進(jìn)ー步純化后，進(jìn)行SDS-PAGE，電泳結(jié)果如圖2所示，圖中，A:低分子量蛋白Marker ；B:分子篩G25復(fù)性后產(chǎn)物；C:親和層析純化后的產(chǎn)物。用BandScan 5.0軟件進(jìn)行灰度分析，親和層析純化后的rhCYGB純度為93.3%。rhCYGB的生物活性檢測(cè):按照T-AOC試劑盒的說(shuō)明書對(duì)rhCYGB抗氧化活性進(jìn)行檢測(cè)和計(jì)算，純化后的rhCYGB抗氧化活性為(95.58±2.67) U/mg (表I)，與兩個(gè)對(duì)照組比較P=0.000，說(shuō)明純化后的rhCYGB具有抗氧化的生物活性。本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
重組人源細(xì)胞珠蛋白在制備治療脂肪肝藥物中的應(yīng)用。

【技術(shù)特征摘要】
1.組人源細(xì)胞珠蛋白在制備治療脂肪肝藥物中的應(yīng)用。2.根據(jù)...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：董文其，魏威，李珍，文健，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：董文其，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：