一種巨噬細胞移動抑制因子及其制備和應用制造技術

本發明專利技術涉及分子生物學領域，具體的說是一種巨噬細胞移動抑制因子MIF及其制備和應用。巨噬細胞移動抑制因子為序列表SEQ?ID?No.1中的氨基酸序列所示。制備方法：以美國紅魚cDNA為模板，用引物F1和R1進行PCR擴增，PCR產物連接表達載體后得質粒pMIF1，將其轉化大腸桿菌BL21(DE3)，通過親和層析純化獲得重組巨噬細胞移動抑制因子MIF。本發明專利技術的巨噬細胞移動抑制因子能夠顯著抑制細菌感染魚類。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及分子生物學領域，具體的說是一種巨噬細胞移動抑制因子MIF及其制備和應用。
技術介紹
巨卩遼細胞移動抑制因子(Macrophagemigration inhibitory factor)是一個約12.5kDa的蛋白，主要由激活的淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞等分泌。巨噬細胞移動抑制因子具有多種功能，包括抑制巨曬細胞定向遷移、調控糖皮質激素(glucocorticoid)介導的免疫抑制效應等，但其主要功能是參與炎癥反應。在哺乳動物中，巨噬細胞移動抑制因子儲存于細胞質中，在外源刺激時(例如病原侵染)，細胞質中的巨噬細胞移動抑制因子迅速釋放質胞外。釋放的巨噬細胞移動抑制因子作為細胞因子而調控急性和慢性炎癥反應，從而影響機體的免疫應答。因此，巨噬細胞移動抑制因子在機體抗細菌、病毒感染反應過程中起重要作用。
技術實現思路
本專利技術目的在于提供一種巨噬細胞移動抑制因子MIF及其應用。為實現上述目的，本專利技術采用的技術方案為:一種巨噬細胞移動抑制因子(MIF)，巨噬細胞移動抑制因子MIF為序列表SEQ IDN0.1中的氨基酸序列所示。巨噬細胞移動抑制因子(MIF)的制備方法:I)質粒pMIF的構 建:以美國紅魚cDNA為模板，用引物Fl和Rl進行PCR擴增，PCR產物純化后與SwaI酶切的質粒PET259用T4DNA連接酶連接，連接液轉化入大腸桿菌，篩選轉化子提取質粒，即為質粒pMIF ；所述Fl 為 5’ -GATATCATGCCGATGTTTGTGGTG-3’，Rl 為 5’ -GATATCGCCAAAGGTAGTGTTGTTCC-3’ ；2)將上述所得質粒轉化大腸桿菌BL21 (DE3)，通過親和層析純化獲得序列表SEQID N0.1所示的巨噬細胞移動抑制因子MI F。巨噬細胞移動抑制因子MIF的應用:所述巨噬細胞移動抑制因子MIF用于制備抗細菌藥物或抗細菌抑制劑。本專利技術具有如下優點:本專利技術的巨噬細胞移動抑制因子能夠顯著抑制細菌侵染。附圖說明圖1為本專利技術實施例提供的經純化的蛋白電泳檢測圖。具體實施方式下面結合實施例對本專利技術作進一步說明。實施例旨在對本專利技術進行舉例描述，而非以任何形式對本專利技術進行限制。在本專利技術實施例中所涉及到的常規性實驗方法均采用如下方法:1.質粒提取、DNA(PCR)產物純化、DNA片段從凝膠中回收皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相應試劑盒。2.大腸桿菌用 Hanahan 方法(Sambrook and Russell:Molecular Cloning: ALaboratory Mannual.Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001)。3.所有限制性內切酶和連接酶皆購自于“紐英倫生物技術有限公司”，北京。實施例1本專利技術的巨噬細胞移動抑制因子MIF為序列表SEQ ID N0.1中的氨基酸序列。序列表SEQ ID N0.1 為:MPMFWNTNVAKCDVPAGLLSEATEELAKAMGKPAQYIAVHINPDQMMMFGGKGDPCALCSLHSIGKISGAHNKQYSKLPCGLLNKHLGISADRIYINFVDMDAANVAWNNTTFG(a)序列特征: 長度:115 類型:氨基酸序列籲鏈型:單鏈 拓撲結構:線性(b)分子類型:蛋白質(C)假設:否(d)反義:否 (e)最初來源:美國紅魚結構特點:該蛋白預期含有一個互變異構酶(tautomerase )結構域(氨基酸10-56)。實施例2重組MIF的制備:I)質粒pMIF的構建:以美國紅魚cDNA為模板，用引物Fl和Rl進行PCR擴增。PCR條件為:94°C 60s預變性模板 DNA，然后 94°C 40s, 57°C 60s, 72°C 60s，5 個循環后改為 94°C 40s, 62°C60s, 72°C 608，30個循環后再在721:延伸反應7-101^11。PCR產物用天根DNA產物純化試劑盒純化。將載體 pET259 (pET259 構建過程參見 Zheng, ff.J.，Hu, Y.H.，Sun, L.，2010.Cloning and analysis of a ferritin subunit from turbot (Scophthalmus maximus).Fish.Shellfish.1mmunol.28，829-836)用SwaI酶切后回收5.4kb片段，將其與上述純化的PCR片段用T4DNA連接酶于室溫連接2-4小時，連接液轉化入大腸桿菌DH5 α，在含卡那霉素(30ug/ml)的LB固 體培養基上培養18-24小時，篩選轉化子提取質粒，即為質粒pMIF。所述LB固體培養基組成成分按重量百分比計:1.0%蛋白胨，0.5%酵母粉，1.0%氯化鈉，1.2%瓊脂，96.3%蒸餾水。所述 Fl 為 5，-GATATCATGCCGATGTTTGTGGTG-3’ ；R1 為5’ -GATATCGCCAAAGGTAGTGTTGTTCC-3’。2 )重組MIF的表達純化將上述的質粒pMIF用常規方法轉化大腸桿菌BL21 (DE3)(購自于“天根生化科技有限公司”，北京)，在含有卡那霉素(30ug/ml)的LB固體培養基上培養18-24小時，挑取一個轉化子，將其命名為BL21/pMIF。將BL21/pMIF于含有卡那霉素(30ug/ml)的LB液體培養基中過夜培養；取Iml過夜后的培養液，加入IOOml新鮮的含有卡那霉素(30ug/ml)的LB液體培養基中，于37°C下轉速200rpm搖動培養至0D_為0.6，加入終濃度為0.3mM的IPTG，30°C繼續以轉速160rpm搖動培養5_6h，而后以5000g，4°C離心lOmin，收集菌液，加入5ml裂解液，在室溫于搖床上緩慢搖動1-2小時，直至菌懸液變澄清為止。將菌液以lOOOOg，4 離心30min,回收上清液。將上清液采用蛋白親和層析柱His Trap HP Columns (購于美國GE Healthcare公司)回收純化,純化的蛋白經SDS-PAGE電泳檢測(8v/cm電壓下電泳25-30min，隨后15v/cm電壓下電泳2_2.5h)，發現其分子量與MIF相同，即為重組MIF (參見圖1)。所述裂解液為終濃度的IOmM NaH2PO4, IOmM Tris和8M尿素，pH 8.0。所述LB液體培養基組成成分按重量百分比計:1.0 %蛋白胨，0.5%酵母粉，1.0 %氯化鈉，97.5%蒸餾水。實施例3重組MIF的應用步驟I)蛋白注射將上述實施例2步驟2)的重組MIF在PBS中稀釋至0.8mg/ml,即為MIF稀釋液。將10條美國紅魚(重約560g)隨機分為2組，每組5條。將這2組分別命名為A和B。將A組的每條魚腹腔注射IOOul MIF稀釋液，將B組(對照組)的每條魚腹腔注射IOOul PBS0所述PBS組成成分按重量百分比計:0.8 % NaCl, 0.02 % KCl, 0.358 %Na2HPO4.12H20, 0.024 % NaH2PO4,余量為水。步驟2)細菌懸液制備在LB培養基中培養遲緩愛德華氏菌TXl至OD6tltl為0.8，然后離心(5000g，4°C，lOmin)，收集菌體，將本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種巨噬細胞移動抑制因子（MIF），其特征在于：巨噬細胞移動抑制因子MIF為序列表SEQ?ID?No.1中的氨基酸序列所示。

【技術特征摘要】
1.一種巨噬細胞移動抑制因子(MIF)，其特征在于:巨噬細胞移動抑制因子MIF為序列表SEQ ID N0.1中的氨基酸序列所示。2.一種權利要求1所述的巨噬細胞移動抑制因子(MIF)的制備方法，其特征在于: 1)質粒PMIF的構建: 以美國紅魚cDNA為模板，用引物Fl和Rl進行PCR擴增，PCR產物純化后與SwaI酶切的質粒PET259用T4DNA連接酶連接，連接液轉化入大腸桿菌，篩選轉化子提取質粒，即為質粒 pMIF ...

【專利技術屬性】
技術研發人員：孫黎，邱礽，
申請(專利權)人：中國科學院海洋研究所，
類型：發明
國別省市：