本發明專利技術涉及一種胃癌靶向重組毒素及其制備方法，屬于靶向重組毒素及其制備方法。利用人胃泌素G17與綠膿桿菌外毒素A衍生的重組毒素PE38KDEL連接形成的具有胃癌靶向的重組毒素，特別是利用原核表達系統表達的反向翻譯的G17作為導向單元，通過基因工程表達制備該重組毒素；并建立其獨特的規模化生產可溶性蛋白的發酵條件，提供了一種靶向胃癌的具有高度選擇殺傷活性重組毒素。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及的是利用基因工程制備胃癌靶向重組毒素。
技術介紹
胃癌在全世界范圍內是發病率最高的癌癥之一，是中國的第二大常見腫瘤。手術是目前唯一根治胃癌的方法，但只有不足1/3的人能夠進行手術治療，對于中晚期病人除進行手術治療外常配合化療、放療等治療手段；但化療和放療副作用太大，往往嚴重破壞患者的免疫系統。40年前，Moolten FL等提出的免疫毒素概念為癌癥的治療帶來一片光明；免疫毒素的策略是利用抗原-抗體、細胞因子-受體的特異性結合，基于腫瘤細胞表面的特殊標志物或特異的受體或與正常細胞受體數量的巨大差異，以其作為靶向使毒素集中于腫瘤細胞周圍，最終將腫瘤細胞殺死而對正常細胞無損害。目前許多重組毒素已進入臨床試驗。美國已有I種藥物(DT-1L2，0NTAK)上市，另有15種進入I期以上的臨床試驗，國內朱平領導的研究小組研制的LHRH-PE40重組毒素正在進行II期臨床試驗。在血液腫瘤方面，Ant1-Tac(scFv)-PE38 (LMB-2)可靶向殺傷 CD25 (IL-2R)陽性細胞，在臨床I期試驗中對35例的白血病淋巴瘤、霍奇金病患者使用，I例完全緩解，7例部分緩解；RFB4(dsFv)PE38 (BL22)可靶向殺傷⑶22陽性的淋巴瘤細胞，16例白血病患者中 11 例完全緩解，2 例部分緩解；IL6(23)-PE40KDEL 和 IL6 (D24)-linker_PE40KDEL 是兩種新型重組毒素，可選擇性殺傷高表達IL-6受體的白血病細胞；抗0064分子的單鏈抗體片段(m22)與ETA融合形成m22(SCFv)-ETA’可特異性殺傷表達CD64的急性髓性白血病母細胞；TH69與PE融合形成的重組毒素能夠誘導⑶7陽性的白血病T淋巴細胞凋亡。在實體瘤方面，B3 (scFv) -PE38 (LMB-7)、B3 (dsFv) -PE38 (LMB-9)能識別表達 LeY 抗原的乳腺癌、肺癌、結腸癌等腫瘤細胞；e23(dsFv)-PE38(Erb38)、e23(scFv)-PE38KDEL (AR209)都是針對在乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌中過量表達的Erb-B2的重組毒素；TGFa -PE40的衍生物TGF a -PE40-8cys目前已經用于膀胱癌的臨床I期試驗；IGF-1_PE40靶向癌細胞表面的胰島素樣生長因子(IGF-1)，能殺傷乳腺癌細胞、肝癌細胞；IL13-PE38QQR已進入臨床試驗，適應癥為腎癌。作為活性單元的毒素分子,最常用的為白喉毒素(Diphtheria Toxin, DT)、綠膿桿菌外毒素(Pseudomonas Exotoxin, PE),然而由于成人體內大都預存有DT的抗體，因此DT的應用受到一定限制。PE的高毒性及細胞殺傷機制已得到詳細闡述，是制備免疫毒素的一種理想毒素分子:PE是分子量為66kDa的單鏈蛋白，由613個氨基酸殘基組成。PE分三個功能區，即 Domain I>Domain II 和 Domain III, Domain I 由 Ia 和 Ib 組成，Ia 區(l_252aa)是受體結合區，引導PE與靶細胞膜上的受體識別并結合；11區(253-364aa)是跨膜轉位區，它由7個α螺旋組成；111區(400_613aa)是酶活性區，具有ADP-核糖基化的酶學活性。PE通過以下步驟 殺傷細胞:㈠G17取代Ia區與CCK-BR或AnnexinII結合將重組毒素聚集到靶細胞表面，II區使其內化進入細胞內；㈡內化后的PE38KDEL在第279-280位氨基酸處被哺乳動物細胞內的Furin蛋白酶裂解，游離出37kDa的片段；曰維系毒素結構的位于第265位和第287位半胱氨酸之間的二硫鍵被還原；㈣第280-313位氨基酸對毒素在胞液中的轉位起調節作用，毒素轉運至內質網并轉運到胞液中，毒素羧基端KDEL結合至胞內選擇性受體上，第400-602位氨基酸發揮ADP核糖基化活性，使eEF_2失活，阻止肽鏈延伸而抑制蛋白質的合成。PE還可以通過其他途徑誘導細胞凋亡，當阻斷PE對eEF-2的作用后，PE融合毒素仍表現出較強的誘導靶細胞凋亡的功能。PE毒素分子被修飾和改造出現了幾種衍生物，主要是缺失Ia區使其失去細胞結合能力，同時使用KDEL序列替換REDLKJI加其內質網親和性，其細胞毒性增加6倍以上，目前最常用結構有PE40KDEL和PE38KDEL，目的在于減少其分子量、增加細胞毒性、增加分子穿透力和降低體內免疫學反應的副作用。利用反向翻譯的胃泌素17肽作為導向單元，主要根據CCK-BR在胃癌細胞中過表達，表達程度還與腫瘤的浸潤深度、淋巴結及靜脈侵犯、是否有肝轉移有關這一事實；CCK-BR陽性的腫瘤患者預后較差，提示CCK-BR與胃癌的進展有關。臨床上100%的胰腺導管細胞癌有CCK-BR表達，85.0%的導管內乳頭狀胰腺癌及65.8%的浸潤性導管胰腺癌表達CCK-BR，膽管癌CCK-BR陽性率為82.5%，而正常胰腺不表達或微弱表達；腫瘤呈浸潤性生長時比膨脹性生長時表達更多的CCK-BR，纖維化程度越重CCK-BR的表達越高。64%的膽囊腺癌有CCK-BR表達，94%的乳頭狀膽囊腺癌表達CCK-BR。CCK-BR主要存在于胃壁細胞上，調節胃酸分泌，對胃泌素和CCK的親和力相似。對胃癌及臨近粘膜表達胃泌素受體差異的研究顯示，胃癌較周圍粘膜易于表達高含量的胃泌素受體，其表達量與腫瘤的部位和分期相關，胃泌素受體在晚期胃癌中高表達。胃癌細胞以表達高親和力受體為主，含量達(39.54±14.43) fmol/mg蛋白，而周圍和正常細胞以表達低親和力受體為主，含量為(6.03±2.83) fmol/mg 蛋白。總之，作為導向的結合 單元，其受體在腫瘤細胞與正常細胞上表達數量的差別是其準確殺傷腫瘤細胞而不損傷正常細胞的關鍵因素。Watson SA證實每個MKN45細胞含有3X IO3個CCK-BR，正常胃細胞上的CCK-BR受體數極少，胃癌及胰腺癌細胞高表達。
技術實現思路
本專利技術涉及，目的是提供一種靶向胃癌的具有高度選擇殺傷活性重組毒素及其制備方法。本專利技術采取的技術方案是:胃癌靶向重組毒素的氨基酸序列是SEQ N0.1。本專利技術所述胃癌靶向重組毒素的制備方法包括下列步驟: 根據表達宿主密碼子的偏愛性，優化基因并進行人工合成，將該基因進行Xba I與EcoRI雙酶切，插入pET_28a載體,轉化大腸桿菌Rosetta(DE3),得到重組菌株Rosetta(DE3)(pET-rG17PE38)，該重組菌株經異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)誘導，目的蛋白獲得高效表達。本專利技術所述基因的核苷酸序列如SEQ N0.2所述。本專利技術所述誘導條件是:S0B培養基，1%接種量接種，160rpm 37°C搖培2h后加入終濃度為1.0 mM的異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷IPTG，180rpm 30°C繼續4.5h。本專利技術胃癌靶向重組毒素的制備方法中還包括蛋白純化方法: 對所獲得的目的蛋白，超聲300W破碎5min，離心取上清；45%的硫酸銨沉淀后，0.4M硫酸銨、20mM Tris、pH7.4的緩沖液重懸，過濾后進行Phenyl FF線性純化；目標蛋白峰收集液上DEAE S本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種胃癌靶向重組毒素，其特征在于胃癌靶向重組毒素的氨基酸序列是SEQ?No.1。
【技術特征摘要】
1.種胃癌靶向重組毒素，其特征在于胃癌靶向重組毒素的氨基酸序列是SEQ N0.1。2.權利要求1所述的一種胃癌靶向重組毒素的制備方法，其特征在于包括下列步驟: 根據表達宿主密碼子的偏愛性，優化基因并進行人工合成，將該基因進行Xba I與EcoRI雙酶切，插入pET_28a載體,轉化大腸桿菌Rosetta(DE3),得到重組菌株Rosetta(DE3)(pET-rG17PE38)，該重組菌株經異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)誘導，目的蛋白獲得高效表達。3.權利要求2所述的一種胃癌靶向重組毒素的制備方法，其特征在于所述基因的核苷酸序列如SEQ N0.2所述。4.權利要求2所述的一種胃癌靶向重組毒素的制備方法，其特征在于所述誘導條件是:SOB培養基，1...
【專利技術屬性】
技術研發人員：柳增善，宋杰，任洪林，盧士英，李巖松，周玉，張茂林，高世奇，
申請(專利權)人：吉林大學，
類型：發明
國別省市：
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