本發(fā)明專利技術公開了一種絳紅褐鏈霉菌SP3抗菌蛋白母液，按照以下方法制備：A1去菌發(fā)酵濾液的制備：A2采用硫酸銨沉淀法提取抗菌物質，制備活性粗蛋白；利用55%飽和度的硫酸銨鹽析濃度對發(fā)酵液進行粗提取，得到的即為活性粗蛋白；A3?純化抗菌蛋白，得到幾丁質結合抗菌蛋白母液；在雜交竹栽培區(qū)，發(fā)病前噴霧或灌（根）10-50倍（體積比）上述抗菌蛋白，噴霧每株200毫升，防治效果為70-80%；灌根每株100毫升，防治效果為75-85%。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及的是絳紅褐鏈霉菌SP3抗菌蛋白母液及其在制備誘導雜交竹抗病藥劑中的應用。
技術介紹
撐X綠雜交竹是南方重要的經濟用材竹，也是四川等地引種發(fā)展的主要經濟竹種之一。近年來，由絲孢綱真菌暗孢節(jié)菱孢菌[Arthrinium phaeospermum (Corda)M.B.Ellis]引起的雜交竹梢枯病導致?lián)蝀綠雜交竹大面積枯死，造成巨大的經濟損失，極大地威脅著長江中上游地區(qū)退耕還林的進程和生態(tài)屏障的建設。目前主要采用化學防治和營林技術，而生物防治措施研究較少。化學防治雖是一種有效的防治手段，但存在病原菌抗藥性、環(huán)境與食品安全、藥害等許多實際問題，一些化學殺菌劑在許多發(fā)達國家和地區(qū)已嚴格限制使用。而與環(huán)境友好的生物農藥越來越受到人們的青睞，是未來農業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要組成部分。李姝江和憔天敏等從雜交竹健康植株分離到一株銅綠假單胞菌(Pseudomonas aerugin osa) ZB27,用其菌懸液和代謝產物處理對雜交竹梢枯病有較好的防治效果，但銅綠假單胞菌為條件致病菌，作為生防菌劑在田間使用受到限制，而本專利技術涉及的絳紅褐鏈霉菌SP3(本申請人已于2012年09月27日申請中國專利，申請?zhí)枮?01210367119.3，公開號CN102864110A，專利技術名稱:絳紅褐鏈霉菌SP3菌株及其在紅豆杉土傳根病和紅豆杉促生上的應用)對雜交竹生防效果較好，但用其代謝產物一純抗菌蛋白作為誘導因子，誘導植物抗性，提高雜交竹免疫性尚無人報道。誘導抗性，即利用生物或非生物因子激發(fā)植物的防衛(wèi)基因，使植物產生局部的或系統(tǒng)的抗病性而達到防病的效果，在植物病害防治中具有重要的意義。其中，關于化學誘導因子誘導抗性的研究國內外報道很多。另外，利用生物因子誘導植物產生抗性的研究也較多，這些生物因子包括致病菌、弱毒小種、AM真菌、植物根圍促生細菌(PGPR)和放線菌等。隨著研究的深入，發(fā)現一些來源于微生物的誘導因子和微生物一樣可以誘導寄主植物產生防衛(wèi)反應，尤其是誘導植保素的合成和積累。Thakkera等利用從Fusarium oxysporum f.sp cubense獲得的激發(fā)子處理香蕉根部，可引起香蕉葉片防御性相關酶的積累，能有效提高感病品種的抗性Jung等發(fā)現從芽孢桿菌菌株中純化獲得的細菌素(class lid)可誘導大豆PAL、APX> SOD和PPO等活性的增加；Mao等從Alternaria tenuissima的菌絲中純化得到耐熱酸性蛋白激發(fā)子PeaTl，能夠誘導煙草對TMV產生系統(tǒng)抗病性；李云鋒等利用從稻瘟病菌細胞壁中純化獲得的糖蛋白激發(fā)子CSB I (分子量為102 kDa)接種水稻，可引起葉片內P0D、PAL、L0X活性、綠原酸和木質素含量的顯著增加。蔣繼志等從31種微生物中篩選出了兩種放線菌源激發(fā)子，其中放線菌A 5295發(fā)酵液型激發(fā)子誘抗效果最高，達63.97%，并推測發(fā)酵液中有效誘抗物質可能是蛋白質類、多糖類等物質
技術實現思路
本專利技術所要解決的技術問題是針對現有技術的不足提供一種絳紅褐鏈霉菌SP3抗菌蛋白母液及其在制備誘導雜交竹抗病藥劑中的應用。本專利技術涉及的絳紅褐鏈霉菌SP3菌株，本申請人已于2012年09月27日申請中國專利，申請?zhí)枮?01210367119.3，公開號CN102864110A，專利技術名稱:絳紅褐鏈霉菌SP3菌株及其在紅豆杉土傳根病和紅豆杉促生上的應用。本專利技術的技術方案如下:—種絳紅褐鏈霉菌SP3抗菌蛋白母液,按照以下方法制備:Al去菌發(fā)酵濾液的制備:從新鮮培養(yǎng)的斜面菌種制備絳紅褐鏈霉菌SP3孢子懸浮液，調整孢子濃度為108cfu/mL ;然后以1%的接種量接入滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中，于25°C、140r/min振蕩培養(yǎng)4d，發(fā)酵液于8000r/min離心15min,取上清液用0.45 μ m孔徑的微孔濾膜過濾除菌,備用；A2采用硫酸銨沉淀法提取抗菌物質，制備活性粗蛋白；利用55%飽和度的硫酸銨鹽析濃度對發(fā)酵液進行粗提取，得到的即為活性粗蛋白；A3純化抗菌蛋白，得到幾丁質結合抗菌蛋白母液:A31 DE52離子交換層析；A32 Sephadex G-75 凝膠過濾層析；A33 Sephadex G-50 凝膠過濾層析； 所述的絳紅褐鏈霉菌SP3抗菌蛋白母液在制備誘導雜交竹抗病藥劑中的應用，在雜交竹栽培區(qū)，發(fā)病前噴霧或灌根10-50倍(體積比)所述絳紅褐鏈霉菌SP3抗菌蛋白母液，噴霧每株200暈升；灌根每株100暈升。不論是噴霧或是浸根誘導，不同濃度抗菌蛋白處理的病情指數差異顯著，除200倍稀釋液處理與對照差異不顯著外，其余均顯著低于對照(P < 0.05)，其中以10倍稀釋液處理的病情指數最低，分別是23.95和20.89，20倍稀釋液次之。噴霧和浸根兩種誘導方法都以10倍抗菌蛋白稀釋液的誘抗效果最好，分別為56.22%和62.88% ;其次是50倍稀釋液的處理，分別為45.39%和51.18% ;再者，100倍稀釋液的誘抗效均在20%以上；200倍稀釋液誘導后挑戰(zhàn)接種發(fā)病最為嚴重，誘抗效果僅為0.10%和-2.77%。表明隨著抗菌蛋白處理濃度的升高，雜交竹的抗病能力也隨之增強。附圖說明圖1為粗蛋白經DE52離子交換層析結果；圖2為峰5經Sephadex G-75凝膠過濾層析結果；圖3為峰5-4反向HPLC純度檢測結果；圖4為峰5-4經Sephadex G-50凝膠過濾層析結果。具體實施例方式以下結合具體實施例，對本專利技術進行詳細說明。實施例1絳紅褐鏈霉菌SP3抗菌蛋白(幾丁質結合抗菌蛋白母液)制備本專利技術涉及的絳紅褐鏈霉菌SP3菌株，本申請人已于2012年09月27日申請中國專利，申請?zhí)枮?01210367119.3，公開號CN102864110A，專利技術名稱:絳紅褐鏈霉菌SP3菌株及其在紅豆杉土傳根病和紅豆杉促生上的應用。1.去菌發(fā)酵濾液的制作從新鮮培養(yǎng)的斜面菌種制備絳紅褐鏈霉菌SP3孢子懸浮液，調整孢子濃度為108cfu/mL;然后以1%的接種量接入滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基(黃豆餅粉3g，葡萄糖5g，甘油5g，蛋白胨 5g，NaCl 2.5g, CaCO2 2g，蒸餾水 IOOOmL)中，于 25°C、140r/min 振蕩培養(yǎng) 4d，發(fā)酵液于8000r/min離心15min,取上清液用0.45 μ m孔徑的微孔濾膜過濾除菌,備用。2抗菌物質提取方法篩選(I)甲醇、乙醇和丙酮提取取3份去菌發(fā)酵濾液，每份IOOmL,按照1:5 (v/v)的比例分別加入冷甲醇、乙醇和丙酮(_2(TC ),在_2(TC放置IOmin, 10 000r/min離心15min,使沉淀風干,上清液用旋轉蒸發(fā)儀減壓蒸干，沉淀物和蒸干 物分別用0.05mol/L pH8.5 Tris-HCl緩沖液溶解并調整至5mL,測定其抑菌活性(采用杯碟法測定待測物質的抑菌活性。在PDA平板中央接入直徑6mm供試真菌菌絲塊，用打孔器距中心3.0cm處無菌挖取4個孔洞。每孔加入100 μ L待測物質，于25°C培養(yǎng)3-5d測量抑菌帶寬度，下文粗蛋白及抗菌蛋白活性測定均以雜交竹梢枯病菌為指示菌。以加滅菌后的Tris-HCl做對照，每處理均設3個重復。( 2 )硫酸銨沉淀法提取取去菌發(fā)酵濾液IOOmL,在0°C下加入硫酸銨使溶液相對本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種絳紅褐鏈霉菌SP3抗菌蛋白母液，其特征在于，按照以下方法制備：A1去菌發(fā)酵濾液的制備：從新鮮培養(yǎng)的斜面菌種制備絳紅褐鏈霉菌SP3孢子懸浮液，調整孢子濃度為108cfu/mL；然后以1%的接種量接入滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中，于25℃、140r/min振蕩培養(yǎng)4d，發(fā)酵液于8000r/min離心15min，取上清液用0.45μm孔徑的微孔濾膜過濾除菌，備用；A2采用硫酸銨沉淀法提取抗菌物質，制備活性粗蛋白；利用55%飽和度的硫酸銨鹽析濃度對發(fā)酵液進行粗提取，得到的即為活性粗蛋白；A3?純化抗菌蛋白，得到幾丁質結合抗菌蛋白母液：A31??DE52離子交換層析；A32?Sephadex?G?75凝膠過濾層析；?A33?Sephadex?G?50凝膠過濾層析。
【技術特征摘要】
1.一種絳紅褐鏈霉菌SP3抗菌蛋白母液，其特征在于，按照以下方法制備: Al去菌發(fā)酵濾液的制備: 從新鮮培養(yǎng)的斜面菌種制備絳紅褐鏈霉菌SP3孢子懸浮液，調整孢子濃度為IO8Cfu/mL ;然后以1%的接種量接入滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中，于25°C、140r/min振蕩培養(yǎng)4d，發(fā)酵液于8000r/min離心15min,取上清液用0.45 μ m孔徑的微孔濾膜過濾除菌,備用； A2采用硫酸銨沉淀法提取抗菌物質，制備活性粗蛋白；利用55%飽和度的硫酸銨鹽析濃度對...
【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：朱天輝，張麗娜，李姝江，韓珊，譙天敏，
申請(專利權)人：四川農業(yè)大學，
類型：發(fā)明
國別省市：
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