本發明專利技術提供一種樹干畢赤酵母大片段DNA基因組文庫的構建方法，包括如下步驟：（1）提取保藏號為ATCC?NO：58376的樹干畢赤酵母基因組DNA；（2）重組載體的構建；（3）陽性克隆的篩選；（4）陽性克隆的酶切鑒定及文庫的保存。本發明專利技術首次成功構建了樹干畢赤酵母大片段DNA基因組文庫，文庫庫容量大（克隆概率97％），覆蓋率高（N=1.08），運用該基因組文庫成功篩選到了纖維二糖酶相關基因，為未知功能目的基因的篩選、相關基因的功能性研究以及進一步基因水平上的改造以獲得理想工業化生產菌株奠定了基礎。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物工程
，具體涉及構建樹干畢赤酵母大片段DNA基因組文庫的方法及該基因組文庫在篩選未知的功能基因上的應用。
技術介紹
隨著分子生物學及生物工程技術的發展，發現新基因，研究新基因的功能已成為功能基因組學研究的熱點，構建大片段DNA基因組文庫是功能基因組學研究的基本手段?；蚪M文庫是指含有某種生物全部基因隨機片段的重組DNA克隆群體，可真實地反映出該物種基因組的全部信息。基因組文庫主要用來保存物種的遺傳信息，并可用于篩選具有特定功能的未知目的基因。近年來，以植物纖維素為原料發酵生產燃料乙醇已逐漸成為研究熱點，釀酒酵母是傳統的在工業生產中廣為應用的高產乙醇發酵菌種，但該菌種只能發酵葡萄糖，不能發酵木糖。樹干畢赤酵母具有發酵木糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、纖維二糖以及木二糖的能力，對于纖維質原料發酵產燃料乙醇具有重要意義。當前許多學者通過改變發酵條件來提高樹干畢赤酵母發酵產乙醇的得率，但實際生產能力還達不到工業化需求，因此，通過基因水平上的改造來獲得理想菌株十分必要。然而，樹干畢赤酵母基因水平上的研究尚處于起步階段，能夠檢索到的文獻甚少，其基因組測序雖已初步完成，但許多關鍵的功能目的基因序列(如纖維二糖酶相關基因)仍未知。因此，有必要構建樹干畢赤酵母大片段DNA基因組文庫，通過在此基礎上進行未知功能目的基因(如纖維二糖酶相關基因)的篩選以及相關基因的功能性研究，為進一步基因水平上的改造以獲得理想工業化生產菌株奠定基礎。
技術實現思路
針對現有技術存在的上述缺陷，本專利技術的目的是提供一種樹干畢赤酵母大片段DNA基因組文庫的構建方法，本專利技術的另一個目的是提供一種上述樹干畢赤酵母大片段DNA基因組文庫在篩選未知的功能目的基因上的應用。本專利技術的技術方案如下:一種樹干畢赤酵母大片段DNA基因組文庫的構建方法，包括如下步驟:(I)基因組DNA的提取:提取保藏號為ATCC NO:58376的樹干畢赤酵母基因組DNA ；(2)重組載體的構建:將步驟(1)所得基因組DNA以及釀酒酵母表達載體YEpLaclSl分別用限制性內切酶Sau3A I和BamH I于37°C進行酶切，回收酶切后的目的基因片段并連接，得到重組載體；(3)陽性克隆的篩選:將步驟(2)所得重組載體轉化大腸桿菌感受態細胞，采用藍白斑篩選法篩選出陽性克隆并計算出陽性克隆子數；(4)陽性克隆的酶切鑒定及文庫的保存:隨機挑取步驟(3)所得陽性克隆進行擴大培養，提取質粒，用限制性內切酶BamHI進行單酶切鑒定；經鑒定正確后，挑取步驟(3)所得全部陽性克隆混合培養，于-70°C保藏，即構建得到樹干畢赤酵母大片段DNA基因組文庫。其進一步的技術方案為:步驟(2)所述限制性內切酶Sau3A I的酶切為采用微量稀釋法對所述基因組DNA進行部分酶切，所述Sau3A I的稀釋倍數為50 150倍，酶切時間為4 8h，優選地，所述Sau3A I的稀釋倍數為100倍，酶切時間為6h。步驟(3)所述大腸桿·菌感受態細胞為JM109。本專利技術還提供了上述樹干畢赤酵母大片段DNA基因組文庫在篩選未知的功能基因上的應用。本專利技術具有如下有益技術效果:本專利技術提供了一種高效的構建樹干畢赤酵母大片段DNA基因組文庫的方法。本申請人通過該方法首次成功構建了樹干畢赤酵母大片段DNA基因組文庫，該基因組文庫所包含的目的基因片段平均大小可達5000bp，陽性克隆子數目多(3000個)，文庫庫容量大(克隆概率97%)，覆蓋率高(N=L 08)，已覆蓋樹干畢赤酵母Pichia stipitis CBS 5773全部基因；此外，運用該基因組文庫成功篩選到了纖維二糖酶相關基因；本專利技術所建基因組文庫為未知功能目的基因的篩選、相關基因的功能性研究以及進一步基因水平上的改造以獲得理想工業化生產菌株奠定了基礎。附圖說明圖1為本專利技術重組質粒的構建策略圖。圖2為本專利技術樹干畢赤酵母基因組DNA的Sau3A I酶切瓊脂糖凝膠電泳分析圖譜，其中，泳道I為Lambda DNA/Pst I Marker,泳道2為經Sau3A I酶切后的樹干畢赤酵母基因組DNA。具體實施例方式以下結合附圖，并通過實施例對本專利技術進行具體說明。下述實施例中所使用實驗材料如下:細胞系:樹干畢赤酵母Pichia stipitis CBS 5773購自美國模式培養物寄存庫(ATCC)，其保藏號為ATCC NO:58376 ;釀酒酵母W303-1A購自上海北諾生物科技有限公司；大腸桿菌感受態細胞E.coli JMlO購自寶生物工程(大連)有限公司。質粒和酶:釀酒酵母表達載體YEpLaclSl購自上海北諾生物科技有限公司；限制性內切酶Sau3A I和BamH I以及Buffer購自NEB ;蝸牛酶購自Fermentas公司；T4DNA連接酶以及Buffer購自寶生物工程(大連)有限公司。其他試劑:X_Gal和IPTG購自寶生物工程(大連)有限公司；氨芐青霉素購自上海生工生物工程公司；其他試劑均為國產貨及進口分析純試劑。實施例1樹干畢赤酵母Pichia stipitis CBS 5773大片段DNA基因組文庫的構建1.1樹干畢赤酵母基因組DNA提取取樹干畢赤酵母Pichia stipitis CBS 5773接種于YEPD液體培養基中，于30°C振蕩培養過夜，搖床轉速200r/min ;取2mL培養物至5mL離心管中，于6000r/min離心5min,棄去上清液，收集菌體，加入0.5mL酵母染色體提取試劑I (0.lmol/L Na2EDTA-0.9mol/L山梨醇，pH7.5)，重懸菌體；加入30 μ L質量濃度為5mg/mL的蝸牛酶，于37°C處理菌體細胞5h (此時大多數細胞形成原生質體),于6000r/min離心5min,棄去上清液,收集菌體；力口入 0.5mL 酵母染色體提取試劑 II (20mmol/L Na2EDTA-50mmol/L Tris-HCl, ρΗ7.4)，重懸菌體，并加入50 μ L質量體積濃度為10%的SDS，于65°C保溫30min以裂解細胞；加入200 μ L5mol/L的醋酸鉀溶液，冰浴Ih ;于8000r/min離心8min，取上清液移至一干凈離心管中，置于冰浴并加入等體積的異丙醇，靜置15min ;于6000r/min離心5min,棄去上清液,收集菌體沉淀，用75 %的酒精洗滌沉淀兩次；將洗滌后的沉淀物自然晾干，加入30 μ LTE緩沖液(ρΗ7.4)溶解沉淀，于4°C保存備用。1.2重組載體的構建本專利技術重組載體的構建策略參見圖1。限制性內切酶Sau3A I和BamH I為同尾酶，用Sau3A I對樹干畢赤酵母基因組DNA進行部分酶切獲得平均大小為5000bp的DNA片段，同時用BamH I將釀酒酵母表達載體YEpLac 181酶切成線性，將上述酶切產物進行連接，即可構建得到7546bp的重組載體。采用微量稀釋法，取限制性內切酶Sau3A I進行系列稀釋(50 X, 60 X, 70 X, 80 X, 90 X , 100 X , 110 X , 120 X , 130 X , 140 X , 150 X),在 37 O 的條件于不同反應時間(4h，4.5h，5h，5.5h，6h，6.5h，7h，7.5h，8本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種樹干畢赤酵母大片段DNA基因組文庫的構建方法，其特征在于包括如下步驟：（1）基因組DNA的提?。禾崛”２靥枮锳TCC?NO：58376的樹干畢赤酵母基因組DNA；（2）重組載體的構建：將步驟（1）所得基因組DNA以及釀酒酵母表達載體YEpLac181分別用限制性內切酶Sau3AⅠ和BamHⅠ于37℃進行酶切，回收酶切后的目的基因片段并連接，得到重組載體；（3）陽性克隆的篩選：將步驟（2）所得重組載體轉化大腸桿菌感受態細胞，采用藍白斑篩選法篩選出陽性克隆并計算出陽性克隆子數；（4）陽性克隆的酶切鑒定及文庫的保存：隨機挑取步驟（3）所得陽性克隆進行擴大培養，提取質粒，用限制性內切酶BamHⅠ進行單酶切鑒定；經鑒定正確后，挑取步驟（3）所得全部陽性克隆混合培養，于?70℃保藏，即構建得到樹干畢赤酵母大片段DNA基因組文庫。
【技術特征摘要】
1.一種樹干畢赤酵母大片段DNA基因組文庫的構建方法，其特征在于包括如下步驟: (1)基因組DNA的提取: 提取保藏號為ATCC NO:58376的樹干畢赤酵母基因組DNA ； (2)重組載體的構建:將步驟(I)所得基因組DNA以及釀酒酵母表達載體YEpLaclSl分別用限制性內切酶Sau3A I和BamH I于37°C進行酶切，回收酶切后的目的基因片段并連接，得到重組載體； (3)陽性克隆的篩選: 將步驟(2)所得重組載體轉化大腸桿菌感受態細胞，采用藍白斑篩選法篩選出陽性克隆并計算出陽性克隆子數； (4)陽性克隆的酶切鑒定及文庫的保存: 隨機挑取步驟(3)所得陽性克隆進行擴大培養，提取質粒，用限制性內切酶BamH I進行單酶切鑒定；經鑒定正確后，挑取步驟(3)所得全部陽性克...
【專利技術屬性】
技術研發人員：張梁，石貴陽，馬經緯，薛衛，鄢貴龍，
申請(專利權)人：江南大學，
類型：發明
國別省市：
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