一種微生物固定化方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種微生物固定化方法，包括乳酸菌的固定化和Nisin的連續(xù)生產(chǎn)工藝。首先菌體在反應(yīng)器內(nèi)生長并吸附于載體材料上；然后放出游離菌體后加入新鮮培養(yǎng)液，結(jié)合反應(yīng)器的高徑比，控制流速使發(fā)酵液剛好到達(dá)反應(yīng)器底部流出時產(chǎn)物Nisin量達(dá)到最高；最后產(chǎn)物從底部流入產(chǎn)物收集罐。同時使用的載體是可重復(fù)使用的聚氨酯泡沫載體材料，整個過程操作簡單，由于移除了影響乳酸菌生長和生產(chǎn)的兩個限制性因素-營養(yǎng)成分減低和產(chǎn)物引起的低pH-可實(shí)現(xiàn)乳酸菌在較高的Nisin產(chǎn)率下連續(xù)化生產(chǎn)。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)是關(guān)于微生物細(xì)胞固定化技術(shù)的，特別涉及一種新的固定化乳酸菌可連續(xù)化生產(chǎn)的工藝方法。
技術(shù)介紹
乳酸菌素是一類由乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的具有抗菌作用的一類蛋白或經(jīng)過加工的多肽類物質(zhì)，可以抑制或殺死多數(shù)革蘭氏陽性致病菌，少數(shù)對革蘭氏陰性菌有效。經(jīng)過前人的研究發(fā)現(xiàn)，雖然其不能用作抗生素，但可以用作食品防腐劑，并且作為食品防腐劑它具有不會在體內(nèi)蓄積而引起不良反應(yīng)，可降低殺菌溫度，減少熱處理時間等諸多優(yōu)點(diǎn)。到目前為止，唯一商業(yè)化的乳酸菌素只有Nisin (—種乳酸鏈球菌素的天然生物活性抗菌肽)，Nisin本身具有熱穩(wěn)定性，并耐酸、耐低溫貯藏等優(yōu)點(diǎn)。目前Nisin的工業(yè)生產(chǎn)時采用乳酸菌在一定條件下發(fā)酵、提取和加工取得。Nisin分子呈酸性，在酸性底物中較易溶解，pH上升則溶解性和熱穩(wěn)定性均下降。發(fā)酵生產(chǎn)時，乳酸菌還會生產(chǎn)乳酸，乳酸是一種弱酸，隨著發(fā)酵液中乳酸和Nisin的積累，體系的pH會下降，會對乳酸菌細(xì)胞產(chǎn)生一定傷害，使Nisin產(chǎn)量下降，如果調(diào)節(jié)發(fā)酵液PH至適宜菌體生長，則Nisin的溶解性和穩(wěn)定性會下降。細(xì)胞固定化技術(shù)恰能彌補(bǔ)上述生產(chǎn)中的缺陷。而當(dāng)前對于乳酸菌的固定化的研究處于實(shí)驗(yàn)室探索階段，多采用包埋法，載體材料多選用天然有機(jī)載體材料，如海藻酸鹽、卡拉膠、纖維素及其衍生物、瓊脂等，這些材料一般機(jī)械強(qiáng)度較低，傳質(zhì)較差，影響營養(yǎng)物質(zhì)的供給和產(chǎn)物的導(dǎo)出；另外，Nisin本身是一種分子量為3510的多肽，因此在凝膠內(nèi)的擴(kuò)散有可能會受到較大的影響，造成凝膠內(nèi)積累較高濃度的Nisin，從而抑制凝膠內(nèi)乳酸菌細(xì)胞生長和繼續(xù)合成Nisin,使固定化細(xì)胞發(fā)酵液pH下降，Nisin效價降低,使得固定化細(xì)胞生產(chǎn)方式接近于游離細(xì)胞發(fā)酵水平；且固定化細(xì)胞成型操作繁瑣，過程中易染菌，且不能實(shí)現(xiàn)連續(xù)化工業(yè)生產(chǎn)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是改變?nèi)樗峋潭ɑa(chǎn)Nisin在規(guī)?；a(chǎn)道路上停滯不前的現(xiàn)狀，提供一種以吸附法為固定化方法的整套工藝流程，實(shí)現(xiàn)固定化的連續(xù)化生產(chǎn)和便捷操作，以及可以用來研究乳酸菌固定化的連續(xù)化生產(chǎn)效果，為其他微生物固定化的規(guī)?；鸵?guī)范化生產(chǎn)提供依據(jù)。本專利技術(shù)采用全開孔的聚氨酯泡沫作為固定化載體材料同時結(jié)合相應(yīng)的反應(yīng)器，固定化細(xì)胞技術(shù)，可以保護(hù)細(xì)胞不受外界不利條件(如酸、堿、有害離子等)的影響，也不影響傳質(zhì)、營養(yǎng)物質(zhì)的供給和產(chǎn)物的導(dǎo)出，同時保持菌種高活性，且可反復(fù)利用。由于連續(xù)發(fā)酵過程中發(fā)酵液的連續(xù)流加和發(fā)酵產(chǎn)物Nisin和乳酸的及時排出，既減低了發(fā)酵過程中發(fā)酵液的減少對菌體生長和生產(chǎn)的限制，也減少了由于產(chǎn)物的累積所造成的PH的降低對菌體生長和生產(chǎn)的影響。本專利技術(shù)通過如下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn):—種微生物固定化方法，具體包括以下步驟:(1)載體材料預(yù)處理:制備陽離子型聚氨酯泡沫載體，將孔徑為30-60PPI的聚氨酯泡沫載體材料置于3%-10%鹽酸處理15-24小時；(2)反應(yīng)器和材料滅菌:將步驟(1)的陽離子型聚氨酯泡沫載體填充到反應(yīng)器中，進(jìn)行直接在線滅菌；該反應(yīng)器的底部設(shè)置有微孔介質(zhì)；(3)接種:加入乳酸菌培養(yǎng)液，并按5-10%的接種量接入乳酸菌；其中乳酸菌培養(yǎng)基的配比為:酵母膏1.5%，蛋白胨1.5%，磷酸二氫鉀2%，蔗糖1.5%，玉米漿0.3%，半胱氨酸0.023%，無碘精鹽 0.15%, MgSO4.7Η200.015%, pH 為 7.2 ;(4)固定化:采用吸附法，將接種過的反應(yīng)器于25_35°C保溫6_12小時，乳酸菌大量生長并吸附在聚氨酯泡沫表面；(5)連續(xù)發(fā)酵:收集反應(yīng)器中的發(fā)酵液和游離菌體；流加新鮮培養(yǎng)液，控制流速0.l_2rpm，使發(fā)酵產(chǎn)品穩(wěn)定直接流出，由裝有pH=2的鹽酸緩沖液的容器接收。所述步驟(2)中的載體材料的形狀和直徑與反應(yīng)器的形狀和直徑相同。所述步驟(2)中的微孔介質(zhì)為燒結(jié)玻璃，作為固定化載體的支撐物。本專利技術(shù)與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)和效果:1、本專利技術(shù)中載體材料經(jīng)過一定處理后填充入發(fā)酵容器內(nèi)，操作簡單，滅菌方便。2、本專利技術(shù)中接種細(xì)胞和載體材料加入(制作)分開進(jìn)行。3、本專利技術(shù)中菌體固定和連續(xù)發(fā)酵在同一反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行。減少雜菌污染的幾率。4、本專利技術(shù)中使用的載體材料是經(jīng)過滅菌后可以再次接種、重復(fù)使用的材料。5、本專利技術(shù)中再次接種不需要載體重新成型，操作簡單，不易染菌。6、本專利技術(shù)中不斷泵入新鮮培養(yǎng)液，放出發(fā)酵液，可以基本保持體系內(nèi)環(huán)境適于乳酸菌生長，而接收發(fā)酵液的容器內(nèi)加入一定量酸液，使發(fā)酵液中的Nisin穩(wěn)定，實(shí)現(xiàn)連續(xù)化生產(chǎn)。具體實(shí)施例方式本專利技術(shù)的原理是有些載體材料對微生物細(xì)胞有吸附能力，可將細(xì)胞吸附在其表面，由于這些材料一般多孔，培養(yǎng)液及產(chǎn)物傳質(zhì)效果較好，利于被固定的細(xì)胞的生長。本專利技術(shù)采用吸附法，利用有機(jī)多孔材料和細(xì)胞表面之間的靜電引力作用將細(xì)胞固定在材料表面，對細(xì)胞活性影響較小，且培養(yǎng)液及產(chǎn)物傳質(zhì)效果較好。本專利技術(shù)利用有吸附能力的陽離子型聚氨酯泡沫將乳酸菌細(xì)胞吸附固定在其棱表面，使PH為中性的培養(yǎng)液在體系內(nèi)流動，為乳酸菌細(xì)胞提供新鮮的營養(yǎng)物質(zhì)，并帶走會使體系pH下降、對乳酸菌細(xì)胞造成傷害的產(chǎn)物Nisin,實(shí)現(xiàn)Nisin的連續(xù)化生產(chǎn)。本專利技術(shù)的生產(chǎn)工藝包括:填充載體材料；加入發(fā)酵培養(yǎng)液,接種，菌體固定化 ’夾套通恒溫循環(huán)水；通入新鮮培養(yǎng)液,接收發(fā)酵液；定時取樣,檢測發(fā)酵液pH、游離細(xì)胞量和Nisin效價等參數(shù)。上述填充載體材料的形狀和體積是通過發(fā)酵容器容積和工作容積等計算得到。上述新鮮培養(yǎng)液的加入過程是通過蠕動泵實(shí)現(xiàn)，并控制適宜流速。本專利技術(shù)具體實(shí)施例如下。實(shí)施例11.預(yù)處理:將孔徑為30PPI的聚氨酯泡沫載體材料置于3%鹽酸處理24小時。2.滅菌:將處理好的載體材料填充到反應(yīng)器內(nèi)，進(jìn)行整體滅菌。其他管線設(shè)備置于滅菌鍋內(nèi)于121°C，20min進(jìn)行滅菌。然后反應(yīng)器在超凈臺內(nèi)連接加料和放液膠管；在超凈臺外，連接30°C循環(huán)水管路及蠕動泵。3.反應(yīng)器接種:在無菌條件下，向反應(yīng)器內(nèi)加入乳酸菌培養(yǎng)液，直至沒過載體材料頂部；乳酸菌培養(yǎng)基的配比為:酵母膏1.5%，蛋白胨1.5%，磷酸二氫鉀2%，蔗糖1.5%，玉米漿0.3%，半胱氨酸0.023%,無碘精鹽0.15%，MgSO4.7Η200.015%，pH為7.2 ;接菌(5%接種量)。4.乳酸菌固定化:反應(yīng)器接種后有循環(huán)水提供30°C培養(yǎng)環(huán)境，然后穩(wěn)定培養(yǎng)8小時。5.連續(xù)發(fā)酵:固定化結(jié)束后，打開反應(yīng)器出口流出發(fā)酵液，開進(jìn)料泵，控制流速1.5rpm,向冷凝管中打入新鮮培養(yǎng)液，流出發(fā)酵液滴入pH=2的酸液的錐形瓶內(nèi)收集。期間不斷取流出發(fā)酵液檢測菌體濃度、PH值和Nisin效價。實(shí)驗(yàn)測得，最終pH穩(wěn)定在6.5，菌體濃度亦達(dá)到穩(wěn)定，且Nisin效價達(dá)到3000IU/ml, 13個小時的連續(xù)穩(wěn)定發(fā)酵過程中Nisin效價僅有略微下降。實(shí)施例21.預(yù)處理:將孔徑 為60PPI的聚氨酯泡沫載體材料置于10%鹽酸處理16小時。 2.滅菌:將處理好的載體材料填充到反應(yīng)器內(nèi)，進(jìn)行整體滅菌。其他管線設(shè)備置于滅菌鍋內(nèi)于121°C，20min進(jìn)行滅菌。然后反應(yīng)器在超凈臺內(nèi)連接加料和放液膠管；在超凈臺外，連接35°C循環(huán)水管路及蠕動泵。3.反應(yīng)器接種:在無菌條件下，向反應(yīng)器內(nèi)加入乳酸菌培養(yǎng)液，直至沒過載體材料頂部；乳酸菌培養(yǎng)基的配比為:酵母膏1.5%，蛋白胨1.5%，磷酸二氫鉀2%，蔗本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種微生物固定化方法，具體包括以下步驟：?（1）載體材料預(yù)處理：制備陽離子型聚氨酯泡沫載體，將孔徑為30?60PPI的聚氨酯泡沫載體材料置于3%?10%鹽酸處理15?24小時；?（2）反應(yīng)器和材料滅菌：將步驟（1）的陽離子型聚氨酯泡沫載體填充到反應(yīng)器中，進(jìn)行直接在線滅菌；該反應(yīng)器的底部設(shè)置有微孔介質(zhì)；?（3）接種：加入乳酸菌培養(yǎng)液，并按5?10%的接種量接入乳酸菌；其中乳酸菌培養(yǎng)基的配比為：酵母膏1.5%，蛋白胨1.5%，磷酸二氫鉀2%，蔗糖1.5%，玉米漿0.3%，半胱氨酸0.023%，無碘精鹽0.15%，MgSO4·7H2O0.015%，pH為7.2；?（4）固定化：采用吸附法，將接種過的反應(yīng)器于25?35℃保溫6?12小時，乳酸菌大量生長并吸附在聚氨酯泡沫表面；?（5）連續(xù)發(fā)酵：收集反應(yīng)器中的發(fā)酵液和游離菌體；流加新鮮培養(yǎng)液，控制流速0.1?2rpm，使發(fā)酵產(chǎn)品穩(wěn)定直接流出，由裝有pH=2的鹽酸緩沖液的容器接收。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種微生物固定化方法，具體包括以下步驟: (1)載體材料預(yù)處理:制備陽離子型聚氨酯泡沫載體，將孔徑為30-60PPI的聚氨酯泡沫載體材料置于3%-10%鹽酸處理15-24小時； (2)反應(yīng)器和材料滅菌:將步驟(I)的陽離子型聚氨酯泡沫載體填充到反應(yīng)器中，進(jìn)行直接在線滅菌；該反應(yīng)器的底部設(shè)置有微孔介質(zhì)； (3)接種:加入乳酸菌培養(yǎng)液，并按5-10%的接種量接入乳酸菌；其中乳酸菌培養(yǎng)基的配比為:酵母膏1.5%，蛋白胨1.5%，磷酸二氫鉀2%，蔗糖1.5%，玉米漿0.3%，半胱氨酸0.023%，無碘精鹽 0.15%, MgSO4.7Η200...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：朱宏吉，王衛(wèi)華，王立紅，劉朝，喬建軍，
申請(專利權(quán))人：天津大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：