本發(fā)明專利技術(shù)公開了在A549細(xì)胞系中miR-181a-5p具有抑制細(xì)胞增殖和遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并抑制了細(xì)胞集落的大小和數(shù)量，miR-181a-5p通過與靶基因的mRNA的3′-UTR互補(bǔ)，抑制靶基因的翻譯或直接降解靶基因的mRNA。實(shí)驗(yàn)通過熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證了Kras是miR-181a-5p的靶基因，并通過qRT-PCR和western-blot進(jìn)一步驗(yàn)證了下調(diào)作用，所公開的在A549細(xì)胞系中Kras為miR-181a-5p的靶基因是首次報(bào)道，該發(fā)明專利技術(shù)可以為臨床對(duì)非小細(xì)胞肺癌藥物靶向治療提供一定的理論依據(jù)。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于生物
本專利技術(shù)涉及一種miRNA、一個(gè)靶基因及其應(yīng)用。本專利技術(shù)涉及到用solexa測序和軟件預(yù)測miRNA的靶基因、雙熒光素酶報(bào)告基因分析和western-blot技術(shù)驗(yàn)證miRNA的祀基因以及過表達(dá)miR-181a_5p后利用CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞增殖的變化、軟瓊脂實(shí)驗(yàn)檢測對(duì)細(xì)胞集落形成的影響、流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。
技術(shù)介紹
MicroRNA (簡稱miRNA)是非編碼小RNA家族的成員之一，長度為18 25個(gè)堿基，通過堿基互補(bǔ)原理能結(jié)合到靶基因mRNA的3’ -端非編碼區(qū)(3’ -UTR)，抑制靶基因mRNA的翻譯或誘導(dǎo)其降解從而改變靶基因的蛋白表達(dá)水平，并通過細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控體系，對(duì)生物體的發(fā)育、分化、增殖、凋亡、免疫等生理活動(dòng)進(jìn)行精確調(diào)節(jié)。肺癌是癌癥死亡的頭號(hào)殺手，5年生存率不到15 %，其中非小細(xì)胞肺癌(non smallcell lung cancer, NSCLC)占所有肺癌病例的80 %以上。肺癌的發(fā)生伴隨著miRNA豐度的變化，miRNA的表達(dá)具有時(shí)空特異性。在不同組織、不同發(fā)育階段中miRNA的水平有差異。miRNA的表達(dá)異常會(huì)使細(xì)胞表型發(fā)生相應(yīng)的變化，繼而導(dǎo)致疾病的誘發(fā)和腫瘤的形成。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的之一在于提供一種miRNA，其具有抑制非小細(xì)胞肺癌增殖的功能。該miRNA通過solexa測序分析挑選出，為miR-181a_5p,其成熟序列為(5' -aacauucaacgcugucggugagu-3')。經(jīng)CCK-8以及細(xì)胞集落等實(shí)驗(yàn)分析確定。本專利技術(shù)的目的之二在于提供miR-181a_5p在促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡中的應(yīng)用。本專利技術(shù)的目的之三在于提供miR-18la_5p在A549細(xì)胞系中的靶基因是Kras。A549購自中科院生化細(xì)胞所細(xì)胞庫。為達(dá)到上述目的，本專利技術(shù)采用如下技術(shù)手段: 第一步，通過solexa測序結(jié)果,利用qRT_PCR技術(shù)尋找出miR-181a_5p表達(dá)下調(diào)的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系，并在此細(xì)胞系過表達(dá)miR-181a-5p，以檢測其功能。第二步，利用流式細(xì)胞儀技術(shù)和CCK-8技術(shù)，分別檢測過表達(dá)miR-181a_5p后A549細(xì)胞的凋亡、增殖情況。第三步，用軟瓊脂實(shí)驗(yàn)來研究過表達(dá)miR-18la-5p后細(xì)胞集落情況。第四步，將Kras的mRNA的3' -UTR連接到pGL_3載體，其上具有與miR-181a_5p種子序列相互補(bǔ)的堿基。將miR-181a-5p與重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞，48 h后檢測熒光信號(hào)。第五步，western-blot檢測在蛋白水平Kras被下調(diào)情況。附圖說明圖1非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中miR-181a_5p的相對(duì)表達(dá)量； 圖2過表達(dá)miR-181a-5p后抑制A549細(xì)胞的增殖； 圖 3 過表達(dá) miR-181a_5p 后轉(zhuǎn)染 NC、miR-181a_5p 以及 Ant1-miR-181a_5p 后顯微鏡下的細(xì)胞集落形態(tài)； 圖4為過表達(dá)miR-181a-5p轉(zhuǎn)染后平板下的細(xì)胞集落形態(tài)； 圖5為過表達(dá)miR-181a-5p后細(xì)胞集落數(shù)的計(jì)數(shù) 圖6過表達(dá)miR-181a-5p后促進(jìn)A549細(xì)胞的凋亡，其中A為轉(zhuǎn)染NC ;B為轉(zhuǎn)染miR-181a_5p ； 圖7為通過雙熒光報(bào)告基因檢測miR-181a-5p對(duì)Kras的抑制； 圖8為western實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)染miR-181a_5p后Kras的蛋白表達(dá)量； 圖9為通過軟件檢測到的K·ras的相對(duì)蛋白表達(dá)量。具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)例進(jìn)一步闡述本專利技術(shù)。在具體實(shí)驗(yàn)步驟中常規(guī)方法參照《分子克隆》(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed.)及試劑盒相關(guān)步驟。實(shí)施例一:根據(jù)solexa測序結(jié)果,確定miR-181a_5p在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中低表達(dá) 先對(duì)正常小鼠的肺組織和患有非小細(xì)胞肺癌的小鼠的肺組織進(jìn)行取樣，用TRIZOL法提取總RNA。利用TaKaRa公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒構(gòu)建兩種組織的cDNA文庫，以oligo dT為引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，通過變性反應(yīng)和反轉(zhuǎn)錄2步獲得后續(xù)實(shí)驗(yàn)的cDNA。樣品利用Solexa方法測序(Solexa測序由華大基因公司完成)，分析得到的數(shù)據(jù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與小鼠正常肺模型(L1805)相比較，miR-181a-5p的相對(duì)表達(dá)量在小鼠的肺癌模型(L703T2)下調(diào)了 65.6 %，(L822T1)下調(diào)了 85.6 %，(L903T1)下調(diào)了 69.7 %。miR-181a_5p在小鼠肺癌模型的表達(dá)量均有下調(diào)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中miR-34a的表達(dá)顯著下調(diào)(圖1)。實(shí)施例二:miR-181a-5p對(duì)A549細(xì)胞增殖有抑制作用 將A549細(xì)胞均勻的鋪在96孔板中，24 h后將miR-181a_5p的mimics轉(zhuǎn)入A549細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染4-6 h后換掉細(xì)胞培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染前先撤掉含有血清的培養(yǎng)液，用不含血清及抗生素的培養(yǎng)液取代，以提高轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染48 h后，開始用CCK-8法檢測細(xì)胞的活力，每隔24 h檢測一次，檢測波長為450 nm。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-181a_5p的A549細(xì)胞的增殖速度低于對(duì)照組，說明miR-181a-5p對(duì)A549細(xì)胞增殖有抑制作用(圖2)。實(shí)施例三:miR-181a-5p能抑制A549細(xì)胞集落的形成 先配置1.2%的低熔點(diǎn)瓊脂糖溶液，將1.2 g的低熔點(diǎn)瓊脂糖加入100 ml超純水中，滅菌，放4 °C保存。接著配置2XDMEM/E12培養(yǎng)液，每100 ml無血清DMEM/E12培養(yǎng)液中加25 ml FBS和2 %抗生素，再制備單細(xì)胞懸液，接著制備底層瓊脂(終濃度0.6%)，在1.2%的瓊脂糖中加入等體積的2 XDMEM/E12培養(yǎng)液，然后鋪被六孔板，2 ml/孔，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱30 min，備用。最后制備含有細(xì)胞的頂層瓊脂(終濃度為0.3%)，在1.2 %的瓊脂糖溶液中加入兩倍體積2XDMEM/E12培養(yǎng)液，并加入制備好的單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5000/ml，放置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)14-20 day，每周觀察。結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-181a_5p的A549細(xì)胞集落變小，數(shù)目減少。說明miR-18la-5p能抑制A549細(xì)胞集落的形成(圖3、圖4和圖5)。實(shí)施例四:miR-181a-5p促進(jìn)A549細(xì)胞的凋亡 將A549細(xì)胞均勻的鋪在6孔板中，24 h后轉(zhuǎn)染miR-181a_5p的mimics，48 h后，將收集到的細(xì)胞用BD FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I凋亡檢測試劑盒染色細(xì)胞。用流式細(xì)胞技術(shù)檢測A549細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果證明，轉(zhuǎn)染了 miR-181a-5p的A549細(xì)胞凋亡率大于對(duì)照組(圖6)。實(shí)施例五:雙突光素酶報(bào)告基因的分析 將Kras mRNA的3, -UTR連接在pGL_3質(zhì)粒上，該質(zhì)粒上含有SV40的啟動(dòng)子，因?yàn)樵贙ras的:V -UTR上發(fā)現(xiàn)有miR-181a-5p的兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，為了研究那個(gè)結(jié)合位點(diǎn)是主要的結(jié)合位點(diǎn)，克隆的3' -UTR為三種，第一種只包含miR-181a-5p在Kras 3' -UTR的第一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，為280 bp，第二種只包含其在本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種非小細(xì)胞肺癌中miR?181a?5p基因在抑制癌細(xì)胞的增殖及克隆形成中的應(yīng)用。
【技術(shù)特征摘要】
1.一種非小細(xì)胞肺癌中miR-181a-5p基因在抑制癌細(xì)胞的增殖及克隆形成中的應(yīng)用。2.一種非小細(xì)胞肺癌中miR-181...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：馬中良，金由辛，趙波濤，邱翔，田珂，
申請(專利權(quán))人：上海大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：
還沒有人留言評(píng)論。發(fā)表了對(duì)其他瀏覽者有用的留言會(huì)獲得科技券。