本發明專利技術公開了一種提高病毒誘導醋栗番茄內源基因沉默效率的方法，本發明專利技術綜合考慮了影響VIGS沉默效率的多方面因素，通過不同接種方法與接種農桿菌菌液濃度，結合沉默效率：沉默頻率、沉默效力、沉默效果，評價方法得到了醋栗番茄病毒誘導基因沉默的最優體系，適宜的接種方法與濃度提高了沉默效率。用本發明專利技術方法評價VIGS沉默效率時間短、速度快、效率高，可應用于其他植物病毒誘導基因沉默優化體系的評價，為快速驗證基因功能提供了有效的方法。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物工程
，涉及。
技術介紹
病毒誘導的基因沉默與傳統的研究植物基因功能的方法相比，具有簡便高效、周期性短、不需要對植物進行轉化和可以沉默基因家族等特點，并且可以在物種間和物種內不同遺傳背景的植物間進行基因功能的比較。自1995年Kumagai等首次利用重組煙草花葉病毒(tobaccomosaic virus,TMV)在本氏煙中成功沉默了植物內源八氫番爺紅素脫氫酶基因以來，多種VIGS載體相繼得到開發和應用。TRV是目前應用最廣的VIGS載體.它是由TRVl與TRV2兩條RNA病毒鏈組成，TRVl用于輔助載有靶基因片段的TRV2在植物體內移動。TRV病毒載體有病毒癥狀較輕、沉默效率高且持久、各種組織均可產生沉默等優點，因而已被廣泛應用。盡管VIGS技術具有很多優越性，但還有其內在固有的局限性:VIGS很少能夠完全沉默或抑制靶基因的表達，而且沉默水平因不同的植物種類和實驗方法而不同，因此，應結合植物種類使用正確的方法獲得最大沉默效率。影響VIGS沉默效率有多種因子:1.VIGS載體中插入的目的片段，在VIGS載體中插入的目的片段序列和大小均影響VIGS沉默效率。一般插入目的片段大小以300 500bp為宜，否則片段太大會導致載體病毒移動受阻和外源片段丟失且插入片段與目的基因至少要有連續23bp完全相同，兩者序列同源性越高，連續一致序列越長，VIGS效果越好。2.植物培育條件，植物培育條件直接影響病毒侵染和增殖以及植物生長，因此VIGS沉默效果的好壞與植物培育條件密切相關。其中以溫度影響最大，同一載體 在不同寄主上沉默適溫不同。就TRV而言，相對低溫有利于它介導的基因沉默，在番茄上需要低于21°C，而在擬南芥和本氏煙上則以22 25°C最佳。高于28°C幾乎完全抑制TRV介導的VIGS ;相對濕度低有利于TRV介導的VIGS，不利的環境條件可能導致促發VIGS的siRNA的產生和積累，從而阻止VIGS產生。3.寄主生育期，寄主生育期對基因沉默效率影響較大，一般在較小的苗期時進行VIGS誘導接種，基因沉默效率較高，太大和太小都不容易進行有效沉默。研究認為病毒的初始積累量對沉默效率影響較大，因此不同生育期可能對病毒的侵染和增殖有較大影響，從而影響VIGS沉默效率。4.VIGS載體的植物導入方法，VIGS載體的植物導入方法直接影響病毒的初始積累量，進而影響基因沉默的起始，因而顯著影響VIGS沉默效率。不同病毒載體病毒的接種方法不同，目前常用的接種方法主要包括機械接種、金屬粒子轟擊和農桿菌介導的接種。農桿菌介導的方法首先是將VIGS載體導入農桿菌，再以農桿菌液對植物進行接種，是一種簡便、高效、勞動量少的導入方法。就TRV病毒載體而言，在不同植物上農桿菌接種方法，農桿菌菌株以及農桿菌接種液的制備也各不相同。基于VIGS技術的優越性，VIGS已發展成一項可以快速高通量研究植物基因功能的主要技術之一，得到廣泛應用，但VIGS很少能夠完全沉默或抑制靶基因的表達，即使靶基因很少的轉錄本也可能產生功能蛋白，從而干擾對沉默表型的觀察，而且沉默效率因不同的植物種類和實驗方法而不同，因此對沉默效率的評價以及提高沉默效率成為VIGS技術的關鍵。
技術實現思路
本專利技術的目的克服現有技術中的缺陷，提供，利用本專利技術所述的方法獲得的沉默植株，獲得病毒誘導醋栗番茄內源基因最佳沉默體系。其具體技術方案為:，包括以下步驟:(I)重組病毒質粒TRV2-PDS的構建與轉化農桿菌；(2)醋栗番茄幼苗培養；(3)接種農桿菌浸染液于醋栗番茄幼苗；(4)病毒誘導醋栗番茄PDS基因沉默。步驟(I)中，獲得所述重組病毒質粒TRV2-PDS為pTRV2載體與408bp PDS基因片段通過Sac I和Xho I酶切位點連接，連接產物轉化DH5a大腸桿菌，于含有卡那霉素的LB平板上37°C靜置培養12-16h，獲得單克隆菌落，單克隆菌落在含卡那霉素的LB液體培養基中37°C、200rpm/min震蕩培養12_16h，擴繁得到的單克隆菌液通過裂解法提取重組質粒，重組質粒經過Sac I和Xho I雙酶切驗證，獲得TRV2-PDS重組質粒。步驟(I)中，TRV2-PDS重組質粒轉化農桿菌的方法為凍融法，轉化的農桿菌菌株為GV3101，在含有卡那霉素、慶大霉 素、利福平抗生索的LB平板上28 °C靜置培養36_48h，篩選出含有TRV2-PDS質粒的陽性單克隆菌落。步驟⑵中，所述的番茄幼苗特征為，播種后12-14d，子葉展平，真葉剛剛冒出。步驟(3)中，農桿菌浸染液的準備過程為:步驟(I)獲得的含有TRV2-PDS質粒的陽性單克隆農桿菌菌落，在含抗生素的LB液體培養基中28°C、200rpm/min震蕩培養24-36h，取培養液以1: 25比例稀釋于誘導培養基中，繼續培養至OD6tltl為0.5-0.8，取培養產物25ml于離心管中，以5000rpm離心，獲得的菌體用MgCl2+MES(10mM，PH5.6)等體積懸浮，再離心，重新懸浮并調節為0D_2.0、OD6003.0，用上述方法準備TRVl菌液，將TRVl與TRV2或TRV2-PDS菌液等體積混合液用于浸染番茄幼苗。步驟(3)中，所述的接種方法為注射法或摩擦法。步驟(3)中，所述的醋栗番茄幼苗為步驟(2)培養所得，且接種后在人工氣候箱中培養，培養條件為21-23°C、相對濕度50%，光周期為16L-8D。步驟(4)中，基因沉默現象在浸染后12d出現，表現為接種植株出現白化或黃化現象，TRV2-PDS病毒載體成功誘導醋栗番茄PDS基因沉默。本專利技術還進一步提出了病毒誘導醋栗番茄內源基因沉默效率的評價方法，包括以下評價指標:沉默頻率，沉默效力，沉默效果。本專利技術還提供了上述評價指標的計算方法:所述沉默頻率為，含有TRV-PDS重組質粒的農桿菌接種的醋栗番茄植株中，出現白化或黃化癥狀的植株所占的比例。即本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種提高病毒誘導醋栗番茄內源基因沉默效率的方法，其特征在于，包括以下步驟：(1)重組病毒質粒TRV2?PDS的構建與轉化農桿菌；(2)醋栗番茄幼苗培養；(3)接種農桿菌浸染液于醋栗番茄幼苗；(4)病毒誘導醋栗番茄PDS基因沉默。
【技術特征摘要】
1.一種提高病毒誘導醋栗番茄內源基因沉默效率的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)重組病毒質粒TRV2-PDS的構建與轉化農桿菌； (2)醋栗番茄幼苗培養； (3)接種農桿菌浸染液于醋栗番茄幼苗； (4)病毒誘導醋栗番茄PDS基因沉默。2.根據權利要求1所述的提高病毒誘導醋栗番茄內源基因沉默效率的方法，其特征在于，步驟(I)中，獲得所述重組病毒質粒TRV2-PDS為pTRV2載體與408bp PDS基因片段通過Sac I和Xho I酶切位點連接，連接產物轉化DH5 α大腸桿菌，于含有卡那霉素的LB平板上37°C靜置培養12-16h，獲得單克隆菌落，單克隆菌落在含卡那霉素的LB液體培養基中37°C、200rpm/min震蕩培養12_16h，擴繁得到的單克隆菌液通過裂解法提取重組質粒，重組質粒經過Sac I和Xho I雙酶切驗證，獲得TRV2-PDS重組質粒。3.根據權利要求1所述的提高病毒誘導醋栗番茄內源基因沉默效率的方法，其特征在于，步驟(I)中，TRV2-PDS重組質粒轉化農桿菌的方法為凍融法，轉化的農桿菌菌株為GV3101，在含有卡那霉素、慶大霉素、利福平抗生素的LB平板上28 °C靜置培養36_48h，篩選出含有TRV2-PDS質粒的陽性單克隆菌落。4.根據權利要求1所述的提高病毒誘導醋栗番茄內源基因沉默效率的方法，其特征在于，步驟(2)中，所述的番茄幼苗特征為，播種后12-14d...
【專利技術屬性】
技術研發人員：梁燕，李翠，張振才，
申請(專利權)人：西北農林科技大學，
類型：發明
國別省市：
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