本發(fā)明專利技術(shù)提供一種胰島素樣生長因子(IGF-1)聯(lián)合多種細胞因子體外擴增天然殺傷細胞(NK細胞)的新方法，所述方法包括：在CD34+造血干細胞的培養(yǎng)體系中加入下列細胞因子：胰島素樣生長因子IGF-1，干細胞因子SCF，F(xiàn)lt3配體Flt3-L和IL-15。具體地，從骨髓或新生兒臍帶血中分離CD34+造血干細胞，在培養(yǎng)第0天即在培養(yǎng)體系中加入SCF(終濃度20-40ng/ml)，F(xiàn)lt3-L(終濃度40-50ng/ml)，IL-15(終濃度30-50ng/ml)以及IGF-1(終濃度100ng/ml)進行培養(yǎng)，可以使CD34+造血干細胞分化成NK細胞，并且達到進一步提高NK細胞擴增效率及擴增后的NK細胞殺傷功能的目的。采用IGF-1聯(lián)合多細胞因子擴增NK細胞的方法有效地提高了NK細胞體外擴增倍數(shù)，而且擴增出的NK細胞具有更強的殺傷潛能。本發(fā)明專利技術(shù)的NK細胞發(fā)育培養(yǎng)體系具有明顯的擴增優(yōu)勢。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及一種改進的人天然殺傷細胞(NK細胞)體外分化并擴增培養(yǎng)的方法，尤其是能提高NK細胞擴增倍數(shù)及擴增后NK細胞的殺傷潛能的方法。具體地，本專利技術(shù)提供一種胰島素樣生長因子(IGF-1)聯(lián)合多種細胞因子體外分化并擴增NK細胞的新方法，其中用到的細胞因子包括胰島素樣生長因子(IGF-1)、干細胞因子(SCF)、Flt3配體(Flt3_L)和白介素 15(IL-15)。
技術(shù)介紹
目前，體外擴增天然殺傷細胞(NK細胞,natural killer cells)的方法很多。但是，很多體外NK細胞擴增體系所產(chǎn)生的NK細胞數(shù)量不足，擴增后的NK細胞殺傷功能低下，很難滿足臨床應(yīng)用。胰島素樣生長因子即insulin-like growth factor (IGF)-1,作為一類生長因子其生物學功能非常廣泛，已經(jīng)有文獻報道IGF-1也可以促進T、B細胞的發(fā)育和生物學功能；另外臍帶血來源的CD34+造血干細胞在體外經(jīng)多細胞因子如SCF(干細胞因子)、Flt3-L(Flt3配體)以及IL-15(白介素15)刺激可以分化發(fā)育為NK細胞，然而目前的研究成果表明這種體系擴增出的NK細胞數(shù)量有限且殺傷功能較弱。
技術(shù)實現(xiàn)思路
為了克服體外NK細胞擴增倍數(shù)及NK細胞的殺傷功能低下的難題，本專利技術(shù)的目的是提供一種IGF-1聯(lián)合多種細胞因子體外分化并擴增NK細胞的培養(yǎng)方法，該方法不僅能擴增出更多的NK細胞，而且能提高擴增后 NK細胞的殺傷潛能。因此，本專利技術(shù)對NK細胞用于臨床免疫治療具有重大意義。具體地，本專利技術(shù)提供一種胰島素樣生長因子(IGF-1)聯(lián)合多種細胞因子體外分化并擴增NK細胞的培養(yǎng)方法，所述培養(yǎng)方法包括:在CD34+造血干細胞的培養(yǎng)體系中同時加入下列細胞因子:胰島素樣生長因子(IGF-1)，干細胞因子(SCF)，F(xiàn)lt3配體(Flt3_L)和白介素 15(IL-15)。所述方法可以使⑶34+造血干細胞分化成NK細胞，并且達到進一步提高NK細胞擴增效率及擴增后的NK細胞殺傷功能的目的。并且，所述方法有效地提高了 NK細胞體外擴增倍數(shù)，而且擴增出的NK細胞具有更強的殺傷潛能。其中所述⑶34+造血干細胞由骨髓或新生兒臍帶血分離，優(yōu)選由新生兒臍帶血分離。其中IGF-1的終濃度可以為100ng/ml，SCF的終濃度可以為20_40ng/ml，F(xiàn)lt3_L的終濃度可以為40-50ng/ml，IL-15的終濃度為30_50ng/ml。其中所述細胞因子IGF-1、SCF、Flt3_L和IL-15在⑶34+造血干細胞培養(yǎng)的第O天同時加入到培養(yǎng)基中。加入所述細胞因子后，所述⑶34+造血干細胞在5% CO2和37°C下培養(yǎng)28天。在一個優(yōu)選的實施方案中，從新生兒臍帶血分離純化⑶34+造血干細胞，將純化的 CD34+造血干細胞用 SCGM(GMP Serum-free Stem Cell Growth Medium, CellGrO /CellGenix )培養(yǎng)基(購自Gibco公司)重懸，I X IO5細胞/孔，在培養(yǎng)第0天即在培養(yǎng)體系中加入SCF (終濃度30ng/ml)，F(xiàn)lt3_L(終濃度50ng/ml)，IL-15 (終濃度50ng/ml)以及IGF-1 (終濃度100ng/ml)，期間每3_4天半量換液一次，并補充相應(yīng)濃度新鮮細胞因子，于5% C02、37°C培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)28天，即可以獲得大量的高純度的NK細胞。在培養(yǎng)結(jié)束時，對所述培養(yǎng)體系所獲得的NK細胞進行比例的檢測和數(shù)量的統(tǒng)計:在IGF-1聯(lián)合多細胞因子進行體外擴增培養(yǎng)的第28天，計數(shù)并收集細胞進行流式細胞儀檢測，可以發(fā)現(xiàn)加入IGF-1培養(yǎng)體系所獲得的⑶3XD56+NK細胞的比例和絕對數(shù)都顯著提高。在培養(yǎng)結(jié)束時，對所述培養(yǎng)體系所獲得的NK細胞進行功能的檢測:在IGF-1聯(lián)合多細胞因子進行體外擴增培養(yǎng)的第28天，收集細胞進行流式細胞檢測，可以發(fā)現(xiàn)加入IGF-1培養(yǎng)體系所獲得的NK細胞表達perforin和⑶107a顯著上調(diào)，表明NK細胞的殺傷潛能有顯著提高。本專利技術(shù)所用的細胞因子均為市售來源的細胞因子。綜上所述，本 專利技術(shù)提供下列各項:1.一種胰島素樣生長因子聯(lián)合多種細胞因子體外分化并擴增天然殺傷細胞的方法，所述方法包括:在CD34+造血干細胞的培養(yǎng)體系中同時加入下列細胞因子:胰島素樣生長因子(IGF-1)，干細胞因子(SCF)，F(xiàn)lt3配體(Flt3_L)和白介素15 (IL-15)。2.根據(jù)第I項所述的方法，其中所述⑶34+造血干細胞由骨髓或新生兒臍帶血分離。3.根據(jù)第I項所述的方法，其中胰島素樣生長因子IGF-1的終濃度為100ng/ml，干細胞因子SCF的終濃度為20-40ng/ml，F(xiàn)lt3配體Flt3_L的終濃度為40_50ng/ml，IL-15的終濃度為30-50ng/ml。4.根據(jù)第3項所述的方法，其中干細胞因子SCF的終濃度為30ng/ml，F(xiàn)lt3配體Flt3-L的終濃度為50ng/ml，IL-15的終濃度為50ng/ml。5.根據(jù)第I項所述的方法，其中所述細胞因子IGF-1、SCF、Flt3-L和IL-15在⑶34+造血干細胞培養(yǎng)的第O天同時加入到培養(yǎng)基中。6.根據(jù)第I項所述的方法，其中加入所述細胞因子后，所述⑶34+造血干細胞在5% CO2和37°C下培養(yǎng)28天。7.根據(jù)第I項所述的方法，其中所用的培養(yǎng)基為SCGM培養(yǎng)基。附圖說明從下面結(jié)合附圖的詳細描述中，本專利技術(shù)的上述特征和優(yōu)點將更明顯，其中:圖1，IGF-1聯(lián)合多種細胞因子可以顯著提高臍血⑶34+細胞的擴增倍數(shù)。圖2，IGF-1聯(lián)合多種細胞因子可以顯著提高NK細胞的比例和絕對數(shù)量。圖3，IGF-1聯(lián)合多種細胞因子可以顯著提高NK細胞的殺傷潛能。具體實施例方式下面參照具體的實施例進一步描述本專利技術(shù)，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，本專利技術(shù)并不限于這些具體的實施例。實施例中的實驗方法，如無特別說明，均采用本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)，實驗試劑均為市售產(chǎn)品。實施例1:1GF-1明顯促進臍血⑶34+細胞的擴增首先分離純化臍帶血⑶34+造血干細胞，SCGM培養(yǎng)基(GMP Serum-free Stem CellGrowth Medium, CellG.ro /CellGenix ,購自 Gibco 公司)重懸，I X IO5 細胞 / 孔，在培養(yǎng)第O天向培養(yǎng)液中加入多種細胞因子:SCF(終濃度30ng/ml,購自Peprotech公司),Flt3_L(終濃度 50ng/ml,購自 Peprotech 公司)，IL-15 (終濃度 50ng/ml,Peprotech 公司)以及IGF-U終濃度100ng/ml，購自P印rotech公司)，在5% 0)2和37°C下培養(yǎng)28天，期間每周半量換液兩次，并計數(shù)，細胞擴增倍數(shù)有顯著提高(圖1)。實施例2:1GF-1顯著促進NK細胞的發(fā)育分離純化的臍血⑶34+造血干細胞，SCGM培養(yǎng)基重懸，在培養(yǎng)第O天即向培養(yǎng)液中同時加入IGF-U終濃度100ng/ml，購自P印rotech公司)及多種細胞因子:SCF(終濃度 30ng/ml,購自 Peprotech 公司)，F(xiàn)lt3_L(終濃度 50ng/ml,購自 Peprotech 公司)和IL-15 (終濃度50ng/ml，購自P印rotech公本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
一種胰島素樣生長因子聯(lián)合多種細胞因子體外分化并擴增天然殺傷細胞的方法，所述方法包括：在CD34+造血干細胞的培養(yǎng)體系中同時加入下列細胞因子：胰島素樣生長因子IGF?1，干細胞因子SCF，F(xiàn)lt3配體Flt3?L和IL?15。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：魏海明，倪芳，田志剛，孫汭，
申請(專利權(quán))人：中國科學技術(shù)大學，
類型：發(fā)明
國別省市：
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