本發明專利技術屬于植物基因工程技術領域。從甘藍型油菜中克隆得到一個缺磷誘導表達啟動子，它的核苷酸序列如序列表SEQ?ID?NO.1中第1-1459堿基所示。將該啟動子與報告基因GUS融合轉化擬南芥，GUS組織化學分析表明該啟動子只在缺磷條件下具有活性，在正常、缺氮、缺鉀、缺硫以及缺鐵條件下都不具有活性。該啟動子除了應用于耐低磷或磷高效作物的培育外，還可以用于缺磷誘導表達基因調控機制研究。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于基因工程
，具體涉及一種油菜BnPR2基因啟動子及其應用，本專利技術提供了一個油菜缺磷誘導表達啟動子及應用。
技術介紹
磷是植物生長發育必需的大量營養元素，它不僅是植物體內核酸、磷脂、ATP等重要分子的組成成分，而且在能量傳遞和代謝途徑調控中發揮著一系列重要作用。植物主要利用根以磷酸根的形式吸收磷。雖然土壤中磷的總量非常豐富，但由于磷酸根很容易被土壤顆粒以及金屬離子吸附固定，所以土壤中磷的生物有效性非常低，缺磷經常成為限制作物產量的因素。施用磷肥成為目前保障作物產量的重要栽培措施。然而，施入土壤的磷肥當季利用率很低，往往隨水土淋失而進入水體，造成了潛在的水體富營養化等環境問題。另外，磷礦屬不可再生資源，估計60-90年后，易于開采的磷礦將被耗竭。為了實現農業的可持續發展，必須提高磷肥的利用效率，減少磷肥的施用量。培育耐低磷或磷高效的作物品種是一項經濟有效且環境友好的辦法。Gao等(Gao N, Su Y，Min J，Shen W,Shi ff.Transgenic tomato overexpressing ath_miR399d has enhanced phosphorusaccumulation through increased acid phosphatase and proton secretion as well asphosphate transporters.Plant and Soil, 2010, 334:123-136)將擬南芥miR399d 在番爺中超表達。轉基因植株提高了磷轉運子的表達，磷酸酶的活性和質子的分泌，最終表現出較高的憐吸收和葉片憐濃度。Li!等(LiiJ, Gao X, Dong Z, YiJ, An, L.1mproved phosphorusacquisition by tobacco through transgenic expression of mitochondrial malatedehydrogenase from Penicillium oxalicum.Plant Cell Reports, 2012, 31:49-56)的石開究表明，超表達線粒體蘋果酸脫氫酶(MDH)的轉基因煙草提高了對鋁磷、鐵磷和鈣磷的利用能力，增加了對的磷吸收，累積了更多的生物量。現有的植物基因工程通常采用CaMV 35S、Ubi和Actl等組成型啟動子。由于組成型啟動子在不同組織和不同環境 條件下都能驅動下游基因的表達。這不僅浪費能量，而且影響植物正常的生理代謝。因此通過誘導型啟動子或組織特異型啟動子控制實現導入基因的環境誘導表達或組織特異表達具有重要意義。誘導型啟動子(inducible promoter)在正常生長條件下不驅動下游基因的轉錄或者轉錄水平很低，而在某些物理、化學或生物信號的刺激下，可以大幅度地提高基因的轉錄水平。誘導型啟動子的優勢在于可根據需要在植物特定的發育階段或生長環境，讓其接受外界信號而激活下游基因表達；也可以去除誘導信號，停止目的基因表達。誘導型啟動子在基礎研究和生產實踐中均具有重要的應用價值。本專利技術人通過研究甘藍型油菜缺磷誘導表達基因，獲得了一個缺磷誘導表達啟動子，該啟動子能夠用于耐低磷或磷高效作物的培育，也可以用于缺磷誘導表達基因調控機制研究。
技術實現思路
本專利技術的目的在于克服現有技術的缺陷，提供一個缺磷誘導表達啟動子，該啟動子來源于甘藍型油菜(Brassica napus),其位于基因BnPR2的上游。本專利技術所涉及的技術方案是:利用甘藍型油菜缺磷誘導表達基因BnPR2的基因組序列在蕓薹屬序列數據庫中進行BLAST分析，獲得與BnPR2序列一致的白菜BAC。根據BAC序列設計引物，擴增BnPR2的上游序列。然后將該序列與報告基因⑶S融合，構建重組表達載體PBnPK2:⑶S，通過農桿菌介導轉化擬南芥，經過抗生素篩選，PCR鑒定獲得含有BnPR2啟動子的轉基因植株。在正常和缺磷、缺氮、缺鉀、缺硫、缺鐵條件下培養轉基因植株，檢測不同缺素植株的GUS活性，結果只有缺磷植株顯藍色，正常和其它元素缺乏植株沒有藍色顯現，說明BnPR2啟動子具有缺磷誘導性。更詳細的技術方案見《具體實施方式》所述。附圖說明序列表SEQ ID NO:1是本專利技術克隆的甘藍型油菜缺磷誘導表達啟動子的核苷酸序列，其中l_1459bp是本專利技術的啟動子序列，第1460-1501是基因BnPR2的部分核苷酸序列。圖1是重組表達載體PBnPK2:GUS的T-DNA區示意圖。該載體含卡那霉素(Kna)抗性篩選基因。圖2是ΡΒηΡΚ2:⑶S表達載體的酶切鑒定圖。圖3是不同元素缺乏條件下P_2:GUS轉基因擬南芥的⑶S染色結果。其中A，為缺氮處理；B為缺磷處理；C為缺鉀處理；D為缺硫處理；E為缺鐵處理；F為對照。具體實施例方式下面結合具體實施例對本專利技術作進一步說明，但不是限制本專利技術。下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法，例如參見《分子克隆實驗指南》(第三版，科學出版社，北京)。引物合成由北京奧科生物技術有限責任公司完成，序列測定由華大基因科技股份有限公司武漢測序部完成。實施例lBnPR2啟動子的克隆(I)基因BnPR2是專利技術人從甘藍型油菜(Brassica napus,鄂油長莢；劉定富等，甘藍型油菜特長莢突變體的發現和鑒定.湖北農學院學報，1994，14(2):1-5)中分離到的一個缺磷誘導表達基因。正常條件下在油菜根中檢測到該基因微弱表達，在葉片中沒有檢測到表達；缺磷條件下該基因在根和葉中表達量急劇上升。通過對BnPR2的基因序列進行 BLAST 分析(http: //brassica.bbsrc.ac.uk/BrassicaDB/blast_form.html)，在BrassicaDB數據庫中找到與BnPR2序列一致的白菜BAC (登錄號為⑶695313)。根據該BAC序列設計下列引物對:PF: 5 ’ -CCTGCAGGAATTTTAGAATGTTGTGTCG-3，，PR: 5 ’ -TCTAGATCTTTTGATTTGTGGTGTTGTGC-3，。其中帶下劃線的堿基為添加的限制性內切酶位點，引物PF添加了一個Sda I酶切別位點，引物PR添加了一個Xba I酶切位點。以甘藍型油菜 (鄂油長莢)基因組DNA為模板，利用高保真DNA聚合酶KOD plus擴增基因BnPR2的上游序列。PCR反應體系為:DNA (50ng/ μ L) 4.0 μ L，ddH20 9.0 μ L, IOX PCR 緩沖液 2.0 μ L, MgSO4 (25mM) 1.0 μ L，dNTP(2.0mM)2.0μ L,引物 PF (10 μ Μ) 0.8 μ L，引物 PR(10 μ Μ) 0.8 μ L，KOD-plus (IU/μ L) 0.4 μ L0 PCR緩沖液，MgSO4, dNTP，KOD-plus DNA聚合酶均來自東洋紡(上海)生物科技有限公司。PCR反應條件為:94°C預變性3分鐘；94°C變性30秒，58°C退火30秒，68°C延伸2分鐘，35個循環；最后68°C保溫5分鐘。PCR擴增產物在1.0%的瓊脂糖凝膠中電泳，得到大小為1500bp左右的單一條帶。(本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一個甘藍型油菜缺磷誘導表達的啟動子，其核苷酸序列如序列表SEQ?ID?NO.1所示。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：徐芳森，楊廣哲，
申請(專利權)人：華中農業大學，
類型：發明
國別省市：
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。