一種在釀酒酵母蛋白Rav2p的C末端上快速添加FLAG標記的方法，涉及釀酒酵母中Rav2p基因的改造與修飾，屬于分子生物學相關領域。本發明專利技術提供了一種在釀酒酵母蛋白Rav2p的C末端上快速添加FLAG標記，其特征在于使該菌蛋白Rav2p的C末端上帶有FLAG標記，并插入抗生素G418抗性基因KanMX6，有利于重組菌的篩選。利用本發明專利技術人構建的線性DNA，實現對Rav2p的基因改造與修飾，從而構建Rav2p的C末端上含有FLAG標記的釀酒酵母重組菌。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及釀酒酵母中Rav2p基因的改造與修飾，屬于分子生物學相關領域。
技術介紹
V-ATP酶(VacuolarATPase)是一種普遍存在于真核生物的內膜系統的蛋白質大分子，其可以水解ATP來轉移質子，維持細胞的正常生理環境。V-ATP酶在細胞內通過質子的運輸，使細胞器的PH平衡，進而對生物學過程例如細胞膜運輸、蛋白質降解、小分子的偶聯運輸起重要作用。V-ATP酶由兩大結構功能部分共14種亞基組成:一部分是水溶性的V1,由8種亞基組成，主要功能是水解ATP ;另一部分是嵌于膜中的Vtl,由6種亞基組成，主要功能是轉移質子。這兩大部分之間形成一種柄狀結構從而使得這兩部分從功能和結構上成為一個整體。V-ATP酶在萄糖濃度降低時可以可逆分解為VdPV1兩部分來調節酶的活性，RAVE:(reg μ lator of theH+_ATPase of vacuolar and endosomal membranes)在 V-ATP 酶這種活性調節方式中起很重要的作用。RAVE復合物由SkpIp、RavIp和Rav2p三個亞基組成。目前有關RAVE以及RAVE對V-ATP酶活性調節機理的研究很少，但是有研究發現RAVE通過與V-ATP酶V1部分的E亞基和G亞基作用從而調節V-ATP酶的活性。V-ATP酶的活性高低直接影響了細胞對酸性環境耐受性的強弱，利用本專利技術人構建的線性DNA可以實現對Rav2p的基因改造與修飾，或者對在釀酒酵母細胞內Rav2p基因的敲除，從而構建Rav2p基因缺陷型釀酒酵母。這種缺陷型釀酒酵母由于Rav2p的合成能力缺失，RAVE對V-ATP酶的調節機制也被破壞，所以這種缺陷型釀酒酵母對高壓二氧化碳敏感，在食品加工過程中具有實際應用價值
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種在釀酒酵母蛋白Rav2p的C未端上快速添加FLAG標記的方法。該方法經濟有效、方便快捷，不需要設計酶切位點和構建質粒。本專利技術提供了，其特征在于使該菌蛋白Rav2p C末端上帶有FLAG標記，并插入抗生素G418抗性基因KanMX6。，其步驟如下:A、提取釀酒酵母BY4742和釀酒酵母SF838-5A RAVl-Myc13的基因組:(I)從YPD固體培養基上挑取釀酒酵母BY4742單菌落，接種于5ml的YPD液體培養基；從YPD固體培養基上挑取SF838-5A RAVl-Myc13單菌落，接種于5ml的YPD液體培養基，培養過夜；(2)用500 μ I的山梨醇緩沖液懸浮釀酒酵母，加入40μ lU000U/ml的Iyticase和I μ I β -巰基乙醇，混勻后37°C孵育3h，破壞細胞壁；(3)蛋白酶k和RNase去除組蛋白和RNA ；(4)使用平衡酚和氯仿:異戊醇(24: I)分別萃取，離心去除蛋白、多糖等有機質，重復一次；(5)取上層水相，加入2倍體積無水乙醇，-20°C放置lh，12000r/min離心IOmin ；(6)棄上清并置于超凈臺吹干，加入50 μ I ddH20溶解DNA。B、克隆同源左、右臂和KanMX6:(I)以釀酒酵母BY4742基因組為模板，通過引物Rfkanpl、Rfkanp2和Rfkanp5、Rfkanp6來分別擴增同源左、右臂；(2)以釀酒酵母SF838-5A RAVl_Mycl3的基因組為模板，通過引物Rfkanp3和Rfkanp4 來擴增 KanMX6。C、融合同源左、右臂和KanMX6這三個片段:以同源左、右臂和KanMX6為模板,通過引物Rfkanpl、Rfkanp6來融合這三個片段，形成一條完整的DNA片段。D、制作釀酒酵母BY4742感受態: (I)從YPD固體培養基上挑取釀酒酵母BY4742單菌落，接種于30ml的YPD液體培養基；(2)離心收集細胞，用無菌水洗滌一次；(3)用0.1M LiAc處理細胞并分裝。E、將融合產物導入感受態細胞:(I)將分裝的感受態細胞離心收集；(2)加入 PEG4000、LiAc、SS-DNA、融合產物等；(3)熱激發將融合產物導入感受態細胞；(4)加入新鮮的YPD培養基進行預培養；(5)涂布F、驗證融合產物是否整合進釀酒酵母BY4742的基因組中:(I)在同源左右片段的上、下游50bp附近設計驗證引物Y1、Y2 ；YI:GAACTTACGCTTTGTAGGAATGAGC ；Υ2:AATGAGCCAAGCACGAACCTTGC ；(2)提取重組菌基因組；(3)以重組菌株基因組為模板，通過引物Y1、Y2來擴增融合產物，根據PCR的大小可以判斷融合產物有沒有整合到釀酒酵母的基因組上。本專利技術的優點:本專利技術利用融合PCR技術連接三個片段，不需要設計酶切位點和保護堿基，省去了酶切和連接的步驟。相比傳統的方法更加方便快捷，更加經濟有效；本專利技術不需要構建穿梭質粒，將融合的PCR產物導入釀酒酵母就可進行同源重組，省去了對質粒的酶切和連接等步驟；本專利技術將抗生素G418抗性基因KanMX6插入在同源左、右臂之間，待融合產物導入釀酒酵母進行同源重組 后，抗生素G418抗性基因KanMX6便整合到了釀酒酵母的基因組上，使原本對抗生素G418敏感的釀酒酵母BY4742具有了抗性，以便對重組菌株的篩選。附圖說明圖1:1為同源左臂400bp ;2為同源右臂400bp ;3_6為KanMX61741bp ;M為DNA分子量標準；圖2:1為融合產物25IObp ；M為DNA分子量標準；圖3: 1-10為驗證的PCR產物2656bp ；M為DNA分子量標準。具體實施例方式實施例1:—種在釀酒酵母蛋白Rav2p的C末端上快速添加FLAG標記的方法，其步驟如下:從NCBI上查找Rav2p的基因序列，Genebank序列號為NC 001136。A、提取釀酒酵母BY4742和釀酒酵母SF838-5A RAVl-Myc13的基因組:(I)從YPD固體培養基上挑取釀酒酵母BY4742單菌落，接種于5ml的YPD液體培養基；從YPD固體培養基上挑取釀酒酵母SF838-5A RAVl-Myc13單菌落，接種于5ml的YPD液體培養基，30 0C 200rpm培養至OD ^ 3 ;(2)用500 μ I的山梨醇緩沖液懸浮釀酒酵母，加入40μ lU000U/ml的Iyticase和I μ I β -巰基乙醇，混勻后37°C孵育3h，破壞細胞壁；(3) 8000r pm lmin離心棄上清(加速要慢)，加500 μ ITE緩沖液(ph8.0),混勻后加 50 μ 1、10% SDS，加入 10μ l、200mg/ml 蛋白酶 k，再加入 10μ lU0g/ml RNase，37°C孵育Ih蛋白酶k和RNase去除組蛋白和RNA ；(4)加入500 μ I平衡酹,顛倒混勻、靜置5min, 8000r/min離心lmin,移取上層加Λ 250 μ I平衡酚和250 μ I氯仿:異戊醇(24: I)顛倒混勻、靜置5min，加500 μ I氯仿，顛倒混勻、靜置5min,8000r/min離心lmin,取上層水相；(5)取上層水相，加入2倍體積無水乙醇，_20°C放置lh，12000r/min離心IOmin ；(6)棄上清并置于超凈臺吹干，加入50 μ I ddH20溶解DNA。B、克隆同源左、右臂本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種在釀酒酵母蛋白Rav2p的C末端上快速添加FLAG標記的方法，其特征在于使該菌蛋白Rav2pC末端上帶有FLAG標記，并插入抗生素G418抗性基因KanMX6。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：張震宇，顧春銀，李忠浩，楊冬美，
申請(專利權)人：江南大學，
類型：發明
國別省市：
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