一種生物分離與分析技術領域的基于等電聚焦電泳電導率檢測的蛋白樣本前處理效果和實驗操作是否正確評估方法，通過采用固化pH梯度膠條或非固化pH梯度膠條對經過前處理的蛋白質樣品進行等電聚焦處理，根據處理期間的電遷移階段以及擴散階段的電流計算得到電遷移階段以及擴散階段的電導與時間的關系，進而通過電導率衡量蛋白質樣品前處理脫鹽效果和實驗操作是否正確。本發明專利技術可有效識別在IEF過程中電遷移與擴散電導、蛋白質樣本脫鹽處理效果好壞、實驗操作是否正確、以及基于固化pH梯度膠條或非固化pH梯度膠條的IEF實驗，提升復雜蛋白質樣品的IEF和雙向凝膠電泳分析的成功率和穩定性。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及的是一種生物分離與分析
的方法，具體是一種基于電導率檢測的等電聚焦電泳(isoelectric focusing, IEF)測試結果預評估的新方法,該方法具有識別電遷移電流與擴散電流、識別固化PH梯度膠條(IPG strip)與非固化pH梯度膠條(non-1PG strip)、識別蛋白樣本前處理效果好壞、以及識別實驗操作方法正確與錯誤功能的檢測方法。
技術介紹
等電聚焦電泳(IEF)是利用電解質在介質中創造一個pH梯度，同時利用蛋白質具有兩性解尚和等電點的特點，對蛋白質進行聞效分尚富集(P.G.Rightti, In: T.S.Work and R.H.Rurdonj Laboraotary Techniques in Biochemistry and MolecularBioboligyj Elsevier Biomedical Press,Amesterdam New York Oxford,vII，1983，p.1-86，268-313)。IEF電泳技術應用廣泛，它不僅是蛋白質pi表征和純度鑒定的標準分析技術；同時也是復雜蛋白質及其組學研究中的關鍵分離方法(Nilesh STannuj Scott E Hembyj Nature Protocols，I (2006) 1732)，在雙向凝膠電泳中亦是作為關鍵的第一向分離技術(P.H.01 Farrell, J.Biol.Chem.250 (1975) 4007 ；Rolland ADj EvrardB，Guitton N, J.Proteome Res.6 (2007) 683)。基于常規凝膠電泳的IEF技術主要有二種，包括:(i)、管式凝膠IEF技術(L.E.M.Miles，G.E.Simmons, A.Chrambach，Anal.Biochem.49 (1972) 109.) ;(ii)、薄層凝膠 IEF 技術(P.G.Rightti，Ιη:Τ.S.Work and R.H.Rurdonj LaboraotaryTechniques in Biochemistry and Molecular Bioboligy,Elsevier BiomedicalPress, Amesterdam New York Oxford, v II，1983，p.1-86，268-313)。但在這兩種凝膠IEF電泳技術中始終存在pH梯度水平化(plateau of pH gradient, P.Arosioj E.Granaand P.G.Righettij J.Chromatogr., 166 (1978) 55)和 pH 梯度漂移(drifting of pHgradient, H.Rilbej In:Electrofocusing and Isotachophoresis(Editors:B.J.Radolaand D.Graeslin), Walter de Gruyter & C0., Berlin New York，1977，p35_50)，這二種現象造成的IEF不穩定性。并且在雙向凝膠電泳(two dimensional gel electrophoresis，2DE)中，由于管式和薄層凝膠IEF的凝膠很難取出，取出后也很難完整的進行后續的轉移操作；因此，基于常規凝膠的第一向IEF分離技術很難與第二向的SDS-PAGE電泳兼容。為了克服常規凝膠IEF技術穩定性問題以及與SDS-PAGE電泳兼容性問題，Rightti等于上世紀八十年代專利技術了固定化pH梯度(immobilized pH gradient，IPG)膠條以及基于 IPG 膠條的 IEF 技術((A.Gorg3 W.Postelj R.Westermeierj B.Bjellqvistj K.Ekj E.Gianazzaj P.G.Righettij Prot.Biol.Fluids30 (1983) 607 ;Α.Gorg,W.Postelj R.Westermeierj B.Bjellqvistj K.Ekj E.Gianazzaj P.G.Righettij Prot.Biol.Fluids30(1983)607)。由于較好地解決了傳統凝膠IEF技術穩定性和兼容性等問題，基于IPG膠條的IEF是目前應用最廣泛的聚焦電泳技術，已經成為2DE的第一向標準分離技術(Nilesh S Tannuj Scott E Hembyj Nature Protocols，I (2006) 1732)。相關的 IEF 技術體系、IPG膠條以及儀器設備等主要有美國GE公司通用電氣醫療集團生命科學部(http://gehealthcare.bioon.com.cn/)、美國 Bio-Rad 公司(http://www.bio-rad.com/)、以及美國Hoefer Inc 公司(http:// www.hoeferinc.com/)提供。但不論是在常規凝膠IEF技術還是在IPG-1EF技術中始終存在成功率低、重復性差等問題，尤其是不同來源和不同人員準備的蛋白質樣品的IEF和2DE實驗。究其原因，主要是對IEF過程中電遷移和擴散產生的電流在機制上認識不深，對CA的添加及其對電遷移電流的影響尚未闡明，對蛋白質樣品前處理各種鹽份的存在、及其對IEF和電流影響認識不足，尚沒有對IPG-1EF和non-1PG-1EF過程中電流產生的機制進行比較。尤其是沒有對在IEF過程中的電遷移與擴散產生的電流、蛋白質樣品中鹽份對IEF電流影響、IPG-1EF與non-1PG-1EF的電流等進行比較和識別，進而形成新的相關技術體系。
技術實現思路
本專利技術針對現有技術存在的上述不足，提出一種，根據IEF過程中電遷移和擴散階段的電流形成機制，將電遷移電流和擴散電流轉化成電遷移電導與擴散電導，并對IEF中的電遷移電導與擴散電導進行實際對比分析，得到電導率隨時間的變化曲線。本專利技術可以通過監測對比起始狀態下的電導大小來衡量蛋白質樣品前處理脫鹽效果的好壞，或/和評判實驗操作的正確與錯誤，預測聚焦的效果和成功率；如起始電導過高或過低，可提前終止IEF和/或2DE實驗，減少后續的損失。根據C.X.Cao, J.Chromatogr.A813 (1998) 153,等電聚焦電泳過程中電遷移和擴散階段的電流形成機制為:在等點聚焦的起始階段，離子i的電遷移電流權利要求1.一種，其特征在于，通過采用固化PH梯度膠條或非固化pH梯度膠條對經過前處理的蛋白質樣品進行等電聚焦處理，根據處理期間的電遷移階段以及擴散階段的電流計算得到電遷移階段以及擴散階段的電導與時間的關系，進而通過電導率變化衡量蛋白質樣品前處理脫鹽效果及操作正確與否。2.根據權利要求1所述的方法，其特征是，所述的前處理的蛋白質樣品是指:利用透析脫鹽、凝膠過濾脫鹽或超濾脫鹽及其對應不同脫鹽程度處理的樣品，之后冷凍干燥備用。3.根據權利要求1所述的方法，其特征是，所述的固化PH梯度膠條或非固化pH梯度膠條是指:采用被動水化方式，選擇膠條長度為7cm，膠條pH為3-10，水化12h ;上樣量為100 μ g/條，上樣體積為125 μ L/條；環境溫度:25度；測試控本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種基于電導率檢測的等電聚焦電泳測試結果預評估的方法，其特征在于，通過采用固化pH梯度膠條或非固化pH梯度膠條對經過前處理的蛋白質樣品進行等電聚焦處理，根據處理期間的電遷移階段以及擴散階段的電流計算得到電遷移階段以及擴散階段的電導與時間的關系，進而通過電導率變化衡量蛋白質樣品前處理脫鹽效果及操作正確與否。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：曹成喜，郭陳剛，李國慶，劉小平，
申請(專利權)人：上海交通大學，
類型：發明
國別省市：
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