可產生三維立體圖像的光學顯微成像方法技術

可產生三維立體圖像的光學顯微成像方法，涉及光學顯微成像方法。提供一種可產生襯度高、立體感強、細微結構表現豐富、邊界清楚的三維立體圖像的光學顯微成像方法。鏡頭選擇；樣品制備；樣品聚焦；襯度調節。或鏡頭選擇；樣品制備；樣品聚焦；擋光片放置；襯度調節。基本原理：利用單一光源在被觀察樣品周圍制造環形照明光，收集樣品暗場光的同時收集少量明場光，通過調節照明或收集方式調節樣品暗場光在收集光中的比例，可使被觀察的樣品形成襯度高、立體感強、細微結構表現豐富、邊界清楚的三維立體圖像。

【技術實現步驟摘要】
可產生三維立體圖像的光學顯微成像方法
本專利技術涉及光學顯微成像方法，特別涉及一種可產生三維立體圖像的光學顯微成像方法。
技術介紹
可產生三維立體圖像的光學顯微成像方法是應某些特殊樣品的觀察要求而產生的。以透明活細胞樣品為例，由于其與周圍介質有相近光吸收系數，僅在折射率上存在細微差別，因此很難用一般的顯微方法進行觀察。一種解決方法是將其染色，但通常染色后的細胞狀態已經發生改變甚至死亡，無法滿足對活細胞觀察的要求。再以金相材料樣品為例，通常希望獲得材料上的不平整表面、裂紋、微孔、凹陷、晶界等信息，這就要求顯微方法能夠把其表面立體分布情況和有關細微結構都表現出來。為滿足上述需求，目前已發展出的可產生三維立體圖像的顯微方法主要有微分干涉相襯法(DifferentialInterfereContrast，DIC)和霍夫曼調制相襯法(HoffmanModulationContrast，HMC)。微分干涉相襯法所必需部件包括起偏器、檢偏器、微分干涉相襯組件插板(DIK組件插板)。起偏器是把光源變為線偏振光；檢偏器可以使滿足干涉條件的相干光進行干涉。DIK組件插板是微分干涉相襯法的核心部件，其上裝配有以渥拉斯頓棱鏡為基礎改良后的DIC棱鏡。DIK組件插板上有兩個調節旋鈕，其中一個用來調節組成DIC棱鏡的兩個棱鏡間的相對位置，使其厚度產生微小的改變從而引起光程或光程差的微小變化，產生明顯的干涉相襯效果；較小的一個用來調節DIC棱鏡的高低位置，以配合不同倍數物鏡后焦平面位置上的差異，從而確保DIC觀察視場中能獲得均勻的照明。通過以上部件的組合，可以使樣品上出現陰影效果，對圖像起到襯托作用，從而產生具有三維立體感的浮雕圖像。霍夫曼調制相襯法的基本原理是利用斜射光照射，它將相位梯度轉換為光強度變化，可以使厚樣品觀察有立體感。利用霍夫曼調制相襯法實現對樣品的立體成像需要三個專用附件：一個帶狹縫的聚光鏡，與其相對應的帶狹縫(光強度調制)的物鏡，聚光鏡中還有一個可以旋轉的起偏器。照明光經過起偏器后變為偏振光，再經過帶狹縫的聚光鏡，使光通量降低，照射到樣品上的光與樣品相互作用后會產生相位的差別，再經帶狹縫(光強度調制)的物鏡會將相位梯度變化轉換為光強度變化，并將這種襯度放大，從而產生具有立體感的圖像。上述兩種三維成像顯微方法雖可滿足特殊樣品觀察的要求，但均存在以下缺點：首先，在使用不同放大倍數的物鏡時都需要與之對應的一套專用附件；其次，部件繁多，結構復雜，調節困難；再次，對其中某些光學元件(如DIC棱鏡)的光學質量要求甚高，價格昂貴，在一定程度上限制了其更廣泛的應用。
技術實現思路
本專利技術的目的在于克服現有技術的缺點，提供一種可產生襯度高、立體感強、細微結構表現豐富、邊界清楚的三維立體圖像的光學顯微成像方法。本專利技術的基本原理是：利用單一光源在被觀察樣品周圍制造環形照明光，收集樣品暗場光的同時收集少量明場光，通過調節照明或收集方式調節樣品暗場光在收集光中的比例，可使被觀察的樣品形成襯度高、立體感強、細微結構表現豐富、邊界清楚的三維立體圖像。本專利技術所述三維立體圖像的光學顯微成像方法的第一技術方案，該光學顯微成像方法為透射式三維立體成像方法，包括以下步驟：(1)鏡頭選擇：根據待觀察的樣品選取合適的物鏡以及比此物鏡NA值小的聚光鏡，所述聚光鏡需能產生環形照明光，將選取好的鏡頭分別安裝在顯微鏡的物鏡轉盤和聚光鏡平臺上；(2)樣品制備：將樣品固定在載物臺上；(3)樣品聚焦：打開顯微鏡，利用單一光源通過聚光鏡在樣品周圍制造環形照明光，先調節聚光鏡，將光斑聚焦到樣品上，再調節物鏡，使其聚焦到樣品上；(4)襯度調節：此時可觀測到樣品的三維立體光學顯微圖像，通過微調聚光鏡在樣品上的聚焦深度，或通過調節光闌及擋光片的尺寸，或選擇NA值差別不同的物鏡及聚光鏡組合，或使用空間光調制器，可調節樣品暗場光在收集光中的比例，實現襯度調節，可使被觀察的樣品形成襯度高、立體感強、細微結構表現豐富、邊界清楚的三維立體圖像。在步驟(1)中，所述聚光鏡可選擇暗場聚光鏡或選擇普通聚光鏡搭配擋光片。在步驟(3)中，所述單一光源可為白光光源或單色光源，所述單色光源可為激光光源。本專利技術所述三維立體圖像的光學顯微成像方法的第二技術方案，該光學顯微成像方法為反射式三維立體成像方法，包括以下步驟：(1)鏡頭選擇：根據根據待觀察的樣品選取合適的物鏡；(2)樣品制備：將樣品固定在載物臺上；(3)樣品聚焦：打開顯微鏡，利用單一光源入射光，調節物鏡使其光斑聚焦到樣品上；(4)擋光片放置：將尺寸合適的擋光片放置在入射光路中的孔徑光闌處以擋住入射光中心，產生環形照明光；(5)襯度調節：通過調整光闌的大小，即可觀測到樣品的三維立體顯微成像；通過調整光強強度使三維立體顯微圖像明亮清晰，可通過縮小孔徑光闌的大小，或通過使用擋光面積更大的擋光片，或使用空間光調制器來調節樣品暗場光在收集光中的比例，提高成像的襯度，如果光線過暗，且圖像中心出現黑斑，則選擇擋光面積更小的擋光片。在步驟(3)中，所述單一光源可為白光光源或單色光源，所述單色光源可為激光光源。與現有的技術相比，本專利技術具有以下突出的優點和技術效果：(1)本專利技術提供了一種可以實現三維立體成像效果的簡單易行、經濟實用的光學顯微成像方法。(2)本專利技術與微分干涉相襯法和霍夫曼調制相襯法相比，不需要任何外加的專用附件。(3)本專利技術在各種光學顯微鏡上采用各種不同倍率的物鏡，以透射模式或反射模式均可實現。(4)本專利技術的應用范圍廣泛，對樣品無限制。(5)本專利技術的立體成像效果顯著，可以獲得被觀察樣品襯度高、立體感強、細微結構表現豐富邊界清晰的三維立體圖像。(6)本專利技術在實現方式上簡便易行，不需要外加的專用附件，不受顯微鏡類型(倒置或正置顯微鏡)及觀察方式(透射式或反射式)的限制。本專利技術實現的三維立體效果清晰明顯，不受樣品類型的限制，對金相樣品、活細胞樣品、透明或非透明樣品均可實現細節信息清晰豐富的三維立體圖像效果。本專利技術可在細胞生物學、立體生物學以及各種金相材料觀察等領域中廣泛應用。附圖說明圖1為采用本專利技術所述透射式三維立體成像方法，在正置光學顯微鏡上對樣品進行三維立體成像的示意圖(實施例1)。圖2為采用本專利技術所述反射式三維立體成像方法，在倒置光學顯微鏡上對樣品進行三維立體成像的示意圖(實施例2)。圖3為在倒置顯微鏡下采用現有透射明場照明方式對CasKi活細胞進行成像的圖片。圖4為在同一倒置顯微鏡下采用現有透射暗場照明方式對同一CasKi活細胞同一位置進行成像的圖片。圖5為在同一倒置顯微鏡下采用本專利技術對同一CasKi活細胞同一位置進行成像的圖片(實施例3)。圖6為在一倒置顯微鏡下采用現有明場照明方法對一微電極陣列芯片進行成像的圖片。圖7為在同一倒置顯微鏡下采用現有暗場照明方法對同一微電極陣列芯片同一位置進行成像的圖片。圖8為是在同一倒置顯微鏡下采用本專利技術對同一微電極陣列芯片同一位置進行成像的圖片(實施例4)。具體實施方式實施例1采用本專利技術所述透射式三維立體成像方法，在普通正置光學顯微鏡上實現對樣品進行三維立體成像觀察的一種方式。如圖1所示，將樣品4固定在載物臺3上，在樣品4下方利用暗場聚光鏡2或擋光片1產生環形照明光6照射到樣品4上，在樣品4上方由物鏡5收集樣品本文檔來自技高網...

【技術保護點】
可產生三維立體圖像的光學顯微成像方法，其特征在于包括以下步驟：（1）鏡頭選擇：根據待觀察的樣品選取合適的物鏡以及比此物鏡NA值小的聚光鏡，所述聚光鏡需能產生環形照明光，將選取好的鏡頭分別安裝在顯微鏡的物鏡轉盤和聚光鏡平臺上；（2）樣品制備：將樣品固定在載物臺上；（3）樣品聚焦：打開顯微鏡，利用單一光源通過聚光鏡在樣品周圍制造環形照明光，先調節聚光鏡，將光斑聚焦到樣品上，再調節物鏡，使其聚焦到樣品上；（4）襯度調節：此時可觀測到樣品的三維立體光學顯微圖像，通過微調聚光鏡在樣品上的聚焦深度，或通過調節光闌及擋光片的尺寸，或選擇NA值差別不同的物鏡及聚光鏡組合，或使用空間光調制器，可調節樣品暗場光在收集光中的比例，實現襯度調節，可使被觀察的樣品形成襯度高、立體感強、細微結構表現豐富、邊界清楚的三維立體圖像。

【技術特征摘要】
1.可產生三維立體圖像的光學顯微成像方法，其特征在于包括以下步驟：(1)鏡頭選擇：根據待觀察的樣品選取合適的物鏡以及比此物鏡NA值小的聚光鏡，所述聚光鏡需能產生環形照明光，將選取好的鏡頭分別安裝在顯微鏡的物鏡轉盤和聚光鏡平臺上；所述聚光鏡為暗場聚光鏡，或為普通聚光鏡搭配擋光片；(2)樣品制備：將樣品固定在載物臺上；(3)樣品聚焦：打開顯微鏡，利用單一光源通過聚光鏡在樣品周圍制造環形照明光，先調節聚光鏡，將光斑聚焦到樣品上，再調節物鏡，使其聚焦到樣品上；(4)襯度調節：通過微調聚光鏡在樣品上的聚焦深度，或通過調節孔徑光闌及擋光片的尺寸，或選擇NA值差別不同的物鏡及聚光鏡組合，或使用空間光調制器，可調節樣品暗場光在收集光中的比例，實現襯度調節，可使被觀察的樣品形成襯度高、立體感強、細微結構表現豐富、邊界清楚的三維立體圖像。2.如權利要求1所述的可產生三維立體圖像的光學顯微成像方法，其特征在于在步驟(3)中，所述單一光源為白光光源或單色光源。3.如權利要求2所述的可產生三維立體圖像...

【專利技術屬性】
技術研發人員：鄭曉姍，任斌，崔顏，宗鋮，劉必聚，
申請(專利權)人：廈門大學，
類型：發明
國別省市：