本發明專利技術涉及一種檢測N-?；呓z氨酸內酯（AHL）的雙標記微生物細胞傳感器，適用于環境中AHL的檢測和宿主細胞的表征。所述細胞傳感器包括：大腸桿菌，大腸桿菌作為宿主細胞承載重組質粒。重組質粒，重組質粒為含有響應AHL的ahlI啟動子、櫻桃紅色熒光蛋白報告基因mcherry、AHL調節蛋白基因ahlR；表征宿主菌的新霉素磷酸轉移酶啟動子基因nptII、綠色熒光蛋白報告基因gfp以及四個終止子rrnb串聯序列T1-4的pUC19質粒。本傳感器可組成型的表達綠色熒光蛋白來表征宿主菌，對AHL的響應時間為6小時，對AHL的最低檢測濃度為50?nmol/L，具有靈敏度高，響應速度快，成本低，操作簡單的特點，可廣泛運用于環境中AHL的檢測和對宿主的表征。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種響應環境中N-?；呓z氨酸內酯的雙標記微生物細胞傳感器的構建及使用。
技術介紹
近年來，人們發現許多細菌在細胞密度達到一定的閾值時可通過對化學信號分子的產生，釋放，感知和反應來調控相關基因的表達從而改變細菌的行為使其適應環境變化，這一現象被稱為“群體感應”(QS:quorum sensing)。群體感應調控許多細菌行為包括:細菌運動、抗生素產生、毒力的產生、細菌結合、孢子的生成、生物膜的生成和環境適應性等。群體感應這些作用的發生依賴于信號分子。目前有三類公認的信號分子:革蘭氏陽性菌的主要信號分子小肽；革蘭氏陰性菌的主要信號分子N-?；呓z氨酸內酯(AHL);革蘭氏陽性菌和陰性菌間都有的autoinducer-2 (A1-2)。因N-酰基高絲氨酸內酯參與調控的細菌行為的廣泛性和結構特性，對其的檢測是研究AHL介導的QS行為的基礎。檢測AHL有兩種方法:一種是物理化學方法，如高效液相色譜法(HPLC)，薄層層析法(TLC)等，其優點是具備高檢測靈敏度和高特異性，但也存在不足，如需要對樣品進行分離提純，對樣品量造成損失并且不能進行環境原位檢測；另一種方法是基于生物有機體和熒光蛋白的生物傳感 器，其優勢是不需對樣品進行提純可直接進行原位檢測。微生物細胞具有易操作，繁殖及生存能力強，易儲存和穩定性高的特點，以微生物細胞為生物學感應元件的微生物細胞傳感器可以極大簡化傳感器的制作過程，提高傳感器的檢測效率。AHL微生物細胞傳感器已成為檢測AHL的重要工具。目前檢測AHL的傳感器主要有兩種:一種是AHL啟動子基因和同源調控蛋白基因以及報告基因組成的重組質粒。當環境中有AHL時，AHL與重組質粒編碼的轉錄調控蛋白結合形成復合物，這一復合物再與啟動子相互作用啟動報告基因表達，產生可檢測的信號，但其缺點是不能表征菌的生長情況，因為菌的生長情況可能影響到包括報告基因蛋白在內的蛋白表達情況，從而影響AHL檢測；另一種是AHL啟動子、報告基因和組成型表達熒光蛋白基因組成的重組質粒。此種質粒無AHL調控蛋白，只能轉化到菌體本身含有AHL調控系統的菌中才能發揮作用，不能對不含AHL調控系統的菌做出表征。
技術實現思路
本專利技術的目的在于針對現有AHL傳感器有的不能表征菌的生長情況，有的不能表征不含AHL系統的菌的問題，利用三部分元件:一是以丁香假單胞菌丁香致病變菌B728aAHL合成酶啟動子ahll為啟動子，櫻桃紅色熒光蛋白基因mcherry為報告基因，構建出的響應AHL的檢測元件Pahll:mcherry, 二是以新霉素磷酸轉移酶啟動子nptll作啟動子,綠色熒光蛋白基因gfp為報告基因，構建出表征宿主生長情況的組成型表達綠色熒光蛋白元件PnptI1:gfp，三是利用丁香假單胞菌丁香致病變菌B728a的AHL調控蛋白基因ahlR元件，可檢測AHL對不含AHL系統的菌的影響情況，構建出既能檢測AHL又能表征菌的生長情況的雙色熒光標記的微生物細胞傳感器。構建該細胞傳感器的具體操作步驟為:1.組成型表達綠色突光蛋白元件Pnptll: gfp的構建以質粒載體pBQ9為模板，PCR擴增得到綠色熒光蛋白基因gfp片段，PCR產物和PUC19質粒載體分別用SphI和PstI雙酶切并純化酶切產物，將gfp片段連入酶切后的PUC19形成載體VI’。以質粒載體pTS為模板，PCR擴增得到新霉素磷酸轉移酶啟動子片段Pnptno PCR產物和載體VI’分別用SalI和PstI雙酶切并純化酶切產物，將Pnptn連入VI’形成載體VI。2.響應 AHL 元件 Pahll: mcherry 的構建以質粒載體pBQ9為模板，PCR擴增得到丁香假單胞菌丁香致病變菌B728a AHL合成酶啟動子ahll和綠色熒光蛋白基 因gfp片段ahl1-gfp，PCR產物和pUC19質粒載體分別用XbaI和XmaI雙酶切并純化酶切產物，將ahll-gfp連入酶切后的pUC19質粒形成載體V2’。以pAN583為模板，PCR擴增得到AHL報告基因櫻桃紅色熒光蛋白基因片段mcherry?；蚱蝝cherry和載體V2’分別用NdeI和HpaI雙酶切并純化酶切產物，將mcherry連入酶切后的載體V2’。片段Pahll: mcherry和質粒載體pUC19分別用XbaI和XmaI雙酶切并純化酶切產物，將Pahll: mcherry連入酶切后的pUC19形成載體V2。3.載體V2中的基因片段Pahll: mcherry連入載體Vl中Pnptn: gfp片段上游分別用XbaI和XmaI雙酶切載體Vl和V2，將酶切后載體V2的小片段Pahll:mcherry連入酶切后的載體Vl的Pnptll: gfp上游，形成載體V3。4.將AHL調控蛋白基因片段ahlR連入載體V3形成載體V4丁香假單胞菌丁香致病變菌B728a AHL調控蛋白基因片段通過PCR的方法獲得。丁香假單胞菌丁香致病變菌B728a在KB液體培養基中(Rif (DMS0溶):200 mg.^),28°C, 200 r.rniiT1條件下培養約48小時，收集菌體，提取基因組。以丁香假單胞菌丁香致病變菌B728a基因組為模版，PCR擴增ahlR基因。PCR產物和載體V3分別用SalI和XalI雙酶切并純化酶切產物，將前者連入后者形成載體V4。5.載體V4基因片段Pahll: mcherry兩端加入串聯終止子形成目標質粒載體V5以質粒載體P麗1009為模板，PCR擴增終止子基因的4個串聯片段1\_4，PCR產物和載體V4分別用XbaI酶切，將前者連入后者形成載體V5’。IV4 PCR產物和載體V5’分別用XmaI酶切，將前者連入后者形成載體V5。6.目標質粒載體V5的表達能力驗證將目標質粒載體轉化不產AHL的大腸桿菌細胞，加入100 nmol/L溶解于乙腈的30C6-HSL溶液，采用Varioskan Flash全波長掃描多功能酶標儀檢測其綠色熒光在488 nm和櫻桃紅色熒光在543 nm處的發射光譜以驗證傳感器細胞對報告基因的表達能力。7目標傳感器細胞的搭建完成利用商業化宿主感受態細胞DH5 α為宿主，將目標質粒載體V5進行轉化，得到既可組成型表達綠色熒光蛋白又能在AHL誘導下表達櫻桃紅色熒光蛋白的響應AHL的雙標記微生物傳感器細胞。具體實施例方式以下實施例將對本專利技術作進一步的說明第一步:接種傳感器細胞單菌落于20 mL三角瓶中，添加氨芐青霉素至終濃度為50 μ g/mL,37°C,200 r.mirT1 過夜培養；第二步:取2 mL的上述菌液到18 mL的新鮮LB培養基中，添加氨芐青霉素至終濃度為 50 μ g/mL，37°C，200 r.mirT1 培養至 OD6tltl=0.6 ；第三步:將溶解于乙腈的30C6-HSL溶液加入第二步培養物中，使其終濃度分別為0、10、50、100、1000 nmol/L, 37°C, 200 r.mirT1 繼續誘導培養；第四步:24小時的誘導時間內每隔3小時取第三步的培養物180μ L至96孔板，采用Varioskan Flash全波長掃描多功能酶標儀分別檢測其綠色突光在488 nm激發光下在510 nm處的發射光強和樓桃紅色突光在543 nm激發光下在610 nm處本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種微生物細胞傳感器，由細菌作基本材料，通過基因工程手段構建，用來檢測環境中N??；呓z氨酸內酯并表征宿主菌。
【技術特征摘要】
1.一種微生物細胞傳感器，由細菌作基本材料，通過基因工程手段構建，用來檢測環境中N-?；呓z氨酸內酯并表征宿主菌。2.根據權利要求1所述的微生物細胞傳感器，其特征在于:不產AHL...
【專利技術屬性】
技術研發人員：莊國強，鄧雪梅，馬安周，
申請(專利權)人：中國科學院生態環境研究中心，
類型：發明
國別省市：
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