一種鉀離子通道蛋白基因、其編碼的蛋白及其應用制造技術

本發明專利技術屬于生物技術領域，具體公開一種鉀離子通道蛋白基因、其編碼蛋白及該基因在植物鉀吸收及耐鹽性方面的應用。本發明專利技術的基因來源于鹽角草，命名為SeAKT1，該基因具有K+吸收功能，能提高轉基因擬南芥在3mM和100μM?K+環境中K+利用率，是一種雙親和性鉀通道蛋白。這預示著它在農作物鉀高效利用方面的應用價值，可減少鉀肥的施用，從而降低生產成本。該基因也能提高轉基因擬南芥在缺鉀及鹽脅迫條件的K+吸收能力，同時減少對Na+的攝入，提高了K+/Na+，從而提高了植物的耐鹽性。這種提高轉基因植物的耐土壤低鉀和耐鹽的特性，可通過轉基因技術應用于農作物上，從而應對日益嚴重的土壤低鉀和鹽漬化問題。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于生物
本專利技術涉及一種鉀離子通道蛋白基因、其編碼的蛋白及該基因在植物鉀高效利用和耐鹽性方面的應用。
技術介紹
鉀是植物生長所必需的大量營養元素之一，廣泛分布于植物的各組織和器官，是植物細胞內含量最豐富的一價陽離子。鉀在植物眾多生理功能中發揮著重要的作用，如維持細胞離子平衡、調節細胞膨壓、調節各種酶的活性以及參與蛋白質合成等，維持高并且相對穩定的鉀含量對植物生長至關重要。植物缺鉀會出現明顯的缺鉀癥狀，表現為易倒伏，葉片易失水，耐旱耐鹽性降低，葉片發黃和組織壞死等。耕地土壤缺鉀會導致農作物產量和品質大幅下降。因此，維持植物生長過程中鉀營養供給十分重要。我國的大部分耕地供鉀不足，其中嚴重缺鉀土地約2000萬公頃，占耕地總面積的20%以上。并且，我國鉀礦資源匱乏，鉀肥的年產量十分有限，缺鉀狀況嚴重影響著我國農業的發展。同時，土壤鹽潰化是一個全球性的生態問題。過量的鈉離子對植物的成長具有毒害作用，大部分農作物在鹽脅迫狀態下不能正常生長，表現為發育遲緩，發芽率降低，器官生長和分化受到抑制，新陳代謝減緩等癥狀。土壤鹽潰化不僅會造成糧食減產，也是土地荒漠化和耕地退化的主要原因之一，嚴重制約著農業生產。研究表明，不同種類的植物或同種植物的不同品種對土壤缺鉀和鹽脅迫的生理反應及對鉀的吸收利用效率存在明顯差異，并且這種差異性是可以遺傳的，說明植物這種性狀是由遺傳基因控制的。在高鹽環境下仍具有鉀吸收能力，進而維持高的K+/Na+比是決定植物的耐鹽性的關鍵因素。因此，植物鉀吸收能力與其耐鹽性息息相關。自從20世紀90年代以來，許多負責植物鉀吸收及轉運的鉀離子通道基因和鉀離子轉運蛋白基因被相繼克隆和鑒定。其中，鉀離子通道在植物鉀吸收中起著重要的作用，研究鉀離子通道基因，為我們深入認識和理解作物體內鉀的吸收及利用機制，進而提高鉀的有效利用率具有積極的作用。目前，已有一些植物的鉀離子通道被克隆并鑒定出來，如OsAKTl (水稻)，AKTl (擬南芥)，ZMK1 (玉米)，MIRK(甜瓜)和MKTl (冰葉日中花)等。然而這些基因大部分來自甜土植物，并且多數對Na+敏感，其中包括來自鹽生植物的MKTl。在土壤既缺鉀又有鹽潰化的情況下，只有對Na+不敏感的鉀轉運蛋白才能正常發揮功能，使轉基因作物既耐低鉀又耐鹽，因此考慮從真鹽生植物鹽角草中分離對Na+不敏感的鉀轉運蛋白基因。所以，本專利采用雙子葉鹽生植物鹽角草為實驗材料。 鹽角草(Salicornia europaea): —年生雙子葉草本植物,藜科鹽角草屬，一般生于鹽堿地、鹽湖旁及海邊。鹽角草屬植物是迄今為止報道過的地球上最耐鹽的陸生高等植物類群之一，其在600mM鹽濃度條件下也能吸收鉀離子，維持植物正常生長。(鹽角草種子采于大連市營城子海邊的鹽堿地，并于實驗室中種植，用含300mM NaCl的l/2Hoagland營養液定期灌溉。自然條件下培養)。
技術實現思路
為了解決上述問題，本專利技術公開一種鉀離子通道蛋白基因、其編碼蛋白及該基因在植物鉀吸收及耐鹽性方面的應用。該基因是從鹽角草中分離出來的，具有K+吸收功能，是一種雙親和性鉀通道蛋白。這預示著它在農作物鉀高效利用方面的應用價值，可減少鉀肥的施用，從而降低生產成本。該基因能提高轉基因擬南芥在缺鉀及鹽脅迫條件的K+吸收能力，同時減少對Na的攝入，提聞了 K /Na ,從而提聞了植物的耐鹽性。這種提聞轉基因植物的耐土壤低鉀和耐鹽的特性，可通過轉基因技術應用于農作物上，從而應對日益嚴重的土壤缺鉀和鹽潰化問題。本專利技術的技術方案如下:本專利技術的目的之一在于提供具有鉀吸收功能的鉀離子通道蛋白基因，該基因是從鹽角草中分離出來的，具有下列核苷酸序列之一:①該基因具有序列表中SEQ ID N0.17或其自5’端38 2614位所示的堿基序列；②該基因與序列表中SEQ ID N0.17或其自5’端38 2614位所示的堿基序列具有95%以上的同源性，且編碼相同蛋白質的堿基序列。本專利技術的目的之二在于提供了具有上文所述鉀離子通道蛋白的編碼蛋白，該蛋白由序列表中SEQ ID N0.18的氨基酸殘基序列組成；且提供了該鉀離子通道蛋白的衍生蛋白質，即由序列表中SEQ ID N0.18的氨基酸殘基經過一個或幾個氨基酸殘基取代、缺失或添加而產生的具有相同的生物學功能的衍生蛋白質的氨基酸序列。本專利技術的目的之三在 于提供一種重組表達載體，該重組表達載體上含有上文所述的鉀離子通道蛋白基因；且在優選的技術方案中，是以PBI121作為表達載體，本專利技術的實施例中，具體公開了重組載體的構建方法和鑒定方法。本專利技術的目的之四在于提供一種含有上文所述重組表達載體的宿主細胞；且在優選的技術方案中，該宿主細胞為根癌農桿菌GV3101菌株，本專利技術的實施例中，具體公開了根癌農桿菌GV3101為宿主菌的實驗方法。本專利技術的目的之五在于提供上文所述的鉀離子通道蛋白基因在提高轉基因植物在不同鉀濃度環境下K+的利用率方面的應用；以及該基因在提高轉基因植物在低鉀和鹽脅迫環境下K+的利用率和耐鹽性方面的應用；尤其在優選的技術方案中，該基因在改良擬南芥性狀中有較好的應用效果。總之，本專利技術的基因SeAKTl具有鉀離子通道蛋白的功能，本專利技術的實施例證明它能提高轉基因擬南芥在3mmol和100 μ mo I濃度K+環境下的K+吸收效率和在缺鉀、鹽脅迫下的K+吸收能力，提高K+/Na+，進而提高植物鉀利用效率及耐鹽性，同時也預示著它在農作物鉀高效利用和耐鹽性方面的應用價值。附圖說明圖1為SeAKTl基因克隆PCR電泳圖。其中，A為保守區部分片段克隆；B為3’端部分片段克隆；C為5’端部分片段克隆；D為ORF全長PCR電泳圖。Ml:DL2000marker ；M2:λ -EcoT14marker。圖中結果顯示:A:克隆所得保守區片段長度約為750bp ；B:克隆所得3’端片段約為2000bp ；C:克隆所得5’端片段長度約為800bp ；D =SeAKTl開放性閱讀框長度為2577bp。將上述克隆所得序列測序后進行blast比對，結果表明所得片段均與Shaker家族鉀離子通道基因存在較高同源性。圖2為本專利技術的SeAKTl基因編碼的蛋白的結構圖。圖中結果顯示該基因具有S1-S6六個跨膜結構域，cNMP結合位點及ANK結構域。從而表明SeAKTl是典型的Shaker家族內向整流型鉀離子通道。圖3為本專利技術的鉀通道蛋白SeAKTl疏水性分析圖。圖中結果顯示該蛋白具有S1-S6六個跨膜結構域，cNMP結合位點及ANK結構域，從而表明SeAKTl是一個跨膜蛋白，并具有Shaker家族鉀離子通道蛋白的一般結構特征。圖4為本專利技術的SeAKTl基因編碼的蛋白的進化分析圖。圖中結果顯示該基因與AKTl亞族中的Mktpl和NKTl等親緣關系較近，表明該編碼蛋白屬于鉀離子通道蛋白家族的AKTl亞族。(鉀離子通道SeAKTl的氨基酸序列采用ClustalX程序預測，并采用MEGA5軟件構建進化樹。AKT1/2/5, KATI/2, AtKCl 和 G0RK/SK0R-擬南芥；SPIK, PeKCl/2-楊樹；NKTl-煙草；RCAKTl/2/3/6-蓖麻；Mktpl-冰葉日中花；DKT1-胡蘿卜；LKT1-西紅柿；TaA本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種鉀離子通道蛋白基因，其特征在于，該基因具有下列核苷酸序列之一：①該基因具有序列表中SEQ?ID?NO.17或其自5’端38～2614位所示的堿基序列；②該基因與序列表中SEQ?ID?NO.17或其自5’端38～2614位所示的堿基序列具有95%以上的同源性，且編碼相同蛋白質的堿基序列。

【技術特征摘要】
1.一種鉀離子通道蛋白基因，其特征在于，該基因具有下列核苷酸序列之一: ①該基因具有序列表中SEQID N0.17或其自5’端38 2614位所示的堿基序列； ②該基因與序列表中SEQID N0.17或其自5’端38 2614位所示的堿基序列具有95%以上的同源性，且編碼相同蛋白質的堿基序列。2.—種鉀離子通道蛋白，其特征在于，該蛋白由序列表中SEQ ID N0.18的氨基酸殘基序列組成。3.—種鐘尚子通道蛋白衍生蛋白質，其特征在于，該蛋白由序列表中SEQ ID N0.18的氨基酸殘基經過一個或幾個氨基酸殘基取代...

【專利技術屬性】
技術研發人員：蘇喬，商玲，
申請(專利權)人：大連理工大學，
類型：發明
國別省市：