等位基因變體檢測方法、試劑盒及組合物技術

本發明專利技術提供利用阻滯子進行等位基因變體特異性檢測的方法、試劑盒及組合物，所述方法包括向核酸樣品中加入引物對及雜交過程中3’端不能被聚合酶延伸的阻滯子，所述引物對包括特異性引物及反向引物；所述特異性引物及反向引物分別與所述核酸樣品中的靶序列突變型寡核苷酸雜交并產生擴增子；所述阻滯子與核酸樣品中的靶序列野生型寡核苷酸雜交；利用所述熒光染料或所述檢測指針對所述突變型等位基因進行實時特異檢測。增加的阻滯子由于在擴增過程中無法延伸，抑制了野生型等位基因變體的擴增，因而提高了突變型等位基因變體的擴增效率，提高了檢測的靈敏度和特異性。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及基因檢測領域，更具體地說，涉及到一種利用等位基因特異性聚合酶鏈式反應(AS-PCR)檢測等位基因變體的方法試劑盒及組合物。
技術介紹
單核苷酸多態性(S NP)是人類基因組中最常見的遺傳多樣性的類型，其在人類基因組DNA中的發生頻率為:1，000個核苷酸中有大約I個SNP，或更低。SNP牽涉于遺傳病癥、對不同疾病的易感性、對藥物的不良反應的傾向性，以及用于法醫研究。因此，SNP(或稀少突變)的檢測為疾病早期診斷，例如檢測血液中的循環癌細胞以進行出生前的診斷，以及用于檢測混合的細胞群體中的疾病相關突變提供了巨大的潛在可能，而利用SNP鑒定與疾病或藥物反應有關的靶基因是當前相關研究的焦點。基于涉及雜交、連接或DNA聚合酶的方法開發了多種用于SNP基因分型的方法。例如，等位基因特異性聚合酶鏈式反應(AS-PCR)被廣泛應用于檢測DNA序列變異，然而，AS-PCR利用了 DNA聚合酶的保真度:相對于以匹配的3’堿基進行的引物延伸，以錯配的3’堿基進行的引物延伸的效率要低得多，后者的效率為前者的1/100至1/100,000。然而，AS-PCR的特異性和選擇性高度依賴于PCR的指數擴增性質，這使得PCR區分等位基因的能力隨著擴增循環的增加而迅速降低。雖然引物可設計為匹配特異性變體以選擇性地僅擴增該變體，但是在實際中，錯配的引物經常仍然能夠發生顯著的擴增。此外，AS-PCR區分等位基因變體的能力會受到突變類型或者突變或SNP周圍的序列的影響、存在于樣品中的等位基因變體的量的影響、以及與備擇等位基因之間的比例的影響。綜合起來，這些因素常導致經常出現假陽性結果，使AS-PCR的可信度有待替提升。用于區分等位基因變體的另一種涉及探針雜交方法的技術是基因分型。然而，與AS-PCR—樣，使用該方法的選擇性受到局限，并且不適合于檢測混合樣品中的稀少(^ 1，000個中的I個)等位基因或突變。
技術實現思路
本專利技術的目的是針對現有的探針雜交方法例如AS-PCR或基因分型在等位基因的變體檢測上檢測率低的問題，提供一種等位基因變體檢測方法、試劑盒及組合物。本專利技術就上述技術問題提供的技術方案如下:本專利技術提供一種等位基因變體檢測方法，包括以下步驟:向核酸樣品中加入突變型等位基因的特異性引物及其反向引物以及在雜交過程中3’端不能被聚合酶延伸的阻滯子，并加入熒光染料或檢測指針，所述核酸樣品中包含靶序列的突變型寡核苷酸及靶序列的野生型寡核苷酸，所述突變型寡核苷酸包含所述突變型等位基因，所述阻滯子與所述野生型寡核苷酸序列互補，所述野生型寡核苷酸包含野生型等位基因，所述突變型等位基因與所述野生型等位基因具有相同的基因座；所述靶序列的野生型寡核苷酸與所述阻滯子雜交，所述突變型寡核苷酸與所述突變型等位基因特異性引物及所述反向引物雜交并產生突變型擴增子；利用所述熒光染料或所述檢測指針對所述突變型等位基因進行實時特異檢測。本專利技術的等位基因變體檢測方法中，所述特異檢測包括:檢測所述熒光染料的熒光變化或檢測所述檢測探針的可檢測性質的變化來檢測所述靶序列上的突變。本專利技術的等位基因變體檢測方法中，所述突變型等位基因與所述野生型等位基因具有相同的基因座。本專利技術的等位基因變體檢測方法中，對應于所述特異性引物的3’端的所述突變型寡核苷酸的至少一個核苷酸不同于所述野生型寡核苷酸的對應位置的核苷酸。本專利技術的等位基因變體檢測方法中，所述阻滯子為嗎啉基或異核酸。本專利技術的等位基因變體檢測方法中，所述阻滯子與所述靶序列的突變型寡核苷酸之間的解離溫度Tm低于所述突變型等位基因特異性引物與所述靶序列的突變型寡核苷酸之間的解離溫度Tm。本專利技術的等位基因變體檢測方法中，所述檢測探針為基因座特異性檢測探針。本專利技術的等位基因變體檢測方法中，所述檢測探針為5 ‘核酸酶探針。本專利技術的等位基因變體檢測方法中，所述核酸樣品中還包括所述聚合酶，脫氧核糖核苷三磷酸dNTP和/或適合于實時聚合酶鏈式反應PCR擴增的緩沖劑。本專利技術的等位基因變體檢測方法中，所述聚合酶為Taq DNA聚合酶。本專利技術的等位基因變體檢測方法中，所述檢測探針為TaqMan探針。本專利技術的等位基因變體檢測方法中,所述核酸樣品為包含腫瘤細胞的血液樣品。本專利技術的等位基因變體檢測方法中，所述腫瘤細胞包含Ras、EGFR、Kit、pTEN、和/或P53中的突變。本專利技術的等位基因變體檢測方法中，所述Ras突變為KRAS突變或BRAF突變。本專利技術的等位基因變體檢測方法中，檢測所述KRAS突變時，使用兩組所述特異性引物、阻滯子及反向引物，其對應關系為:第一組:特異性引物:AGGCACTCTTGCCTACGCCAT阻滯子:AGGCACTCTTGCCTACGCCAC反向引物:GTACTGGTGGAGTATTTGAT第二組:特異性引物:TCAAGGCACTCTTGCCTACGT阻滯子:TCAAGGCACTCTTGCCTACGC反向引物:GTACTGGTGGAGTATTTGAT本專利技術的等位基因變體檢測方法中，所述突變為BRAF突變，使用的所述特異性引物、阻滯子及反向引物及檢測探針的對應關系為:特異性引物:GCCTGATTTTGGTCTAGCTACAGA阻滯子:GCTACAGTGAAATCTC反向引物:AGCCTCAATTCTTACCACAAAA檢測探針:(6-FAM) CAGACAACTGTTCAAACTG (BHQ)本專利技術還提供一種等位基因變體檢測試劑盒，所述等位基因變體檢測試劑盒中包括上述的特異性引物及其反向引物、阻滯子、以及熒光染料或檢測指針。本專利技術還提供一種等位基因變體檢測組合物，所述組合物包括上述特異性引物及其反向引物、阻滯子、以及熒光染料或檢測指針。本專利技術提供的等位基因變體檢測方法、試劑盒及組合物，通過利用阻滯子與靶序列野生型寡核苷酸雜交后無法延伸的特點，使得擴增過程中野生型等位基因變體的擴增受到抑制，因而提高了突變型等位基因變體的擴增效率，進而提高了檢測的靈敏度和特異性。附圖說明下面將結合附圖及實施例對本專利技術作進一步說明，附圖中:圖1為本專利技術的優選的嗎啉基作為阻滯子與DNA分子雜交的示意圖；圖2為本專利技術的優選的異核酸結構中類似脫氧核糖的官能團結構示意圖；圖3為本專利技術的添加阻滯子的情況下靶序列的雜交示意圖；圖4為未使用阻滯子的情況下野生型核苷酸與引物對的雜交示意圖；圖5為使用本專利技術的檢測方法檢測KRAS突變的遺傳序列示意圖；圖6為圖5所示檢測KRAS突變檢測的的擴增曲線圖；圖7為利用本專利技術檢測方法檢測BRAF突變的遺傳序列示意圖；圖8為圖7 所示檢測BRAF突變的檢測結果中Ct值與腫瘤細胞與正常細胞的比值之間的關系圖。具體實施例方式本專利技術主要涉及等位基因變體的檢測方法、試劑盒及組合物。其中主要涉及到的術語具有如下定義:等位基因變體:出現在染色體某特定座位上的兩個或多個基因中的一個的變體形式，所述變體包括單核苷酸多態性(SNP)、插入、反轉、易位及缺失。引物:與靶序列的核苷酸鏈雜交的寡核苷酸。本專利技術中檢測的等位基因來源于核算樣品，所述核算樣品可以使用任何核酸分子，可以是DNA，例如基因組DNA (gDNA)或互補性DNA (cDNA),也可以是RNA，例如信使RNA(mRNA)等。本專利技術的等位基因變體檢測方法具體包括以下步驟本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種等位基因變體檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：向核酸樣品中加入突變型等位基因的特異性引物及其反向引物以及在雜交過程中3’端不能被聚合酶延伸的阻滯子，并加入熒光染料或檢測指針，所述核酸樣品中包含靶序列的突變型寡核苷酸及靶序列的野生型寡核苷酸，所述突變型靶核苷酸包含所述突變型等位基因，所述阻滯子與所述野生型寡核苷酸序列互補，所述野生型寡核苷酸包含野生型等位基因，所述突變型等位基因與所述野生型等位基因具有相同的基因座；所述靶序列的野生型寡核苷酸與所述阻滯子雜交，所述突變型寡核苷酸與所述突變型等位基因的特異性引物及所述反向引物雜交并經擴增產生突變型擴增子；利用所述熒光染料或所述檢測指針對所述突變型等位基因進行實時特異檢測。

【技術特征摘要】
1.一種等位基因變體檢測方法，其特征在于，包括以下步驟: 向核酸樣品中加入突變型等位基因的特異性引物及其反向引物以及在雜交過程中3’端不能被聚合酶延伸的阻滯子，并加入熒光染料或檢測指針，所述核酸樣品中包含靶序列的突變型寡核苷酸及靶序列的野生型寡核苷酸，所述突變型靶核苷酸包含所述突變型等位基因，所述阻滯子與所述野生型寡核苷酸序列互補，所述野生型寡核苷酸包含野生型等位基因，所述突變型等位基因與所述野生型等位基因具有相同的基因座； 所述靶序列的野生型寡核苷酸與所述阻滯子雜交，所述突變型寡核苷酸與所述突變型等位基因的特異性引物及所述反向引物雜交并經擴增產生突變型擴增子； 利用所述熒光染料或所述檢測指針對所述突變型等位基因進行實時特異檢測。2.根據權利要求1所述的等位基因變體檢測方法，其特征在于，所述特異檢測包括: 檢測所述熒光染料的熒光變化或檢測所述檢測探針的可檢測性質的變化來檢測所述靶序列上的突變。3.根據權利要求1所述的等位基因變體檢測方法，其特征在于，對應于所述特異性引物的3’端的所述突變型寡核苷酸的至少一個核苷酸不同于所述野生型寡核苷酸的對應位置的核苷酸。4.根據權利要求3所述的等位基因變體檢測方法，其特征在于，所述阻滯子為嗎啉基或異核酸。5.根據權利要求1所述的等位基因變體檢測方法，其特征在于，所述阻滯子與所述靶序列的突變型寡核苷酸之間的解離溫度Tm低于所述特異性引物與所述靶序列的突變型寡核苷酸之間的解離溫度Tm。6.根據權利要求1-5任一項所述的等位基因變體檢測方法，其特征在于，所述檢測探針為基因座特異性檢測探針；所述核酸樣品中還包括所述聚合酶，脫氧核糖核苷三磷酸dNTP和/或適合于實時聚合酶鏈式反應PCR擴增的緩沖劑。7.根據權...

【專利技術屬性】
技術研發人員：羅曉騰，
申請(專利權)人：深圳聯合醫學科技有限公司，
類型：發明
國別省市：