HSPC117分子作為RNA連接酶的用途制造技術

本發明專利技術涉及HSPC117分子作為RNA連接酶的用途，連接RNA分子的方法，用于這些方法和用途的試劑盒和轉基因細胞。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】HSPC117分子作為RNA連接酶的用途
本專利技術涉及細胞和分子生物學工具領域，尤其是涉及RNA連接酶，及用于分析和治療的使用及抑制RNA連接酶的方法。
技術介紹
天然的連接RNA或DNA的酶通常將具有磷?；暮怂岱肿釉?’位置接合到具有羥基的第2核酸分子在3’位置。在能量轉移步驟中5’端的磷酸通常由ATP提供。轉移RNA (tRNA)是對于信使RNA (mRNA)翻譯成蛋白必要的銜接子分子。類似于其他RNA分子，使前體tRNA轉錄物(前-tRNA)在它們實現它們的生物學功能之前經歷擴展的翻譯后加工。除了移出5’ -前導序列和3’ -尾隨序列，擴展的堿基和糖修飾和核苷酸的模板-獨立添加之外，一些tRNA不得不經歷干擾序列的切除。tRNA內含子的移出由不同于mRNA的規范剪接體-依賴性加工的剪接過程實現。tRNA剪接還需要切下內含子的特化的內切核酸酶和用于接合外顯子半的連接酶(圖W。W02004/087884A2描述用于篩選涉及tRNA加工的小有機分子的方法。Pascal etal., Current Opinion in Structural Biologyl8 (I) (2008): 96-105 涉及 PNA 和 RNA 連接酶中的差異。Kato et al., Journal of Molecular Biology239 (5) (2003):903-911 描述嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus)的 RNA 連接酶的晶體結構。Wang et al., RNAll (6)(2005):966-975 實施了酵母 tRNA連接酶的結構-功能分析。Okada et al., PR0TEINS63 (4)(2006): 1119-1122提供來自超嗜熱火球菌(Pyrococcus horikoshii )的RtcB同源蛋白，一種RNA環化酶的晶體結構。 盡管tRNA基因中內含子的存在似乎是在全部生命域中共通的，剪接機理的進化在連接步驟明顯分歧。已描述可歸因于不同生命界的2種主要的連接通路(Abelson等人，1998)。真菌及植物分化體使用由與噬菌體T4RNA連接酶I同源的單多功能多肽催化的共同的連接機理。此通路需要環狀磷酸二酯酶和多核苷酸激酶活性的作用，以制備用于隨后連接的外顯子末端。結果，來源于三磷酸核苷(NTP)供體的外源磷酸合入成熟tRNA (圖1A,上枝)。相反，動物和古細菌分化體可通過在內切核酸酶反應后直接接合2’，3’-環磷酸和5’-羥基(5’-0H)左末端來連接tRNA外顯子(Laski等人，1983)。此連接酶反應(圖1A，降低枝)依賴于2’，3’-環狀-磷酸酯終結的RNA (RNA>p)，且導致源于前體的2’，3’-環磷酸并合到作為3’，5’ -磷酸二酯的成熟tRNA的剪接連接部(Fi Iipowicz和Shatkin，1983)。已闡明此RNA>p連接酶反應的關鍵生物化學方面。但是，盡管許多生物化學,生物信息學和遺傳努力，自從起初假定tRNA剪接通路，還未鑒定適合的RNA連接酶。
技術實現思路
因此，本專利技術的目標是提供至少也能使用2’，3’ -環磷酸終結的RNA作為底物的RNA連接酶(〃RNA>p連接酶〃)。此目標由權利要求的主題達到。尤其是，本專利技術涉及HSPC117分子作為RNA連接酶作為分子生物學工具及在治療中的用途。HSPCl 17已被測序(例如.Genbank ACC NO:NP_055121或CAG33456)，及位于第22染色體orf28 (〃C220RF28〃)。HSPC117是由未知的功能的高度保守的結構域(UPR)027)和獨特蛋白折疊表征的細菌/古細菌RtcB基因家族的人同源物。UPR)027蛋白形成在植物或真菌模型生物中無可檢測的代表的直系同源基因(K0G3833)簇。此種系分布高度暗示動物和古細菌中RNA>p連接酶活性的排他性的發生。HSPC117在本文也被稱為HSPC117/C220RF28或RtcB/HSPC117。如本文所用，表述"HSPC117分子〃指稱此簇中任何同源或直系同源分子，其現在已鑒定為催化RNA連接酶反應。該"HSPC117分子〃的例序列在圖6中作為SEQ IDN0:1 SEQ ID NO: 11給出。全部HSPCl 17分子已發現含有對應于SEQ ID NO:1的C122的催化性半胱氨酸殘基。HSPCl 17分子和序列已進一步描述于，例如US2007/0204352A1 (尤其SEQID NO: 15，16，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78)，但是之前無創造性用途的認識。US2007/0204352A1涉及潛在地涉及α -突觸核蛋白的聚集的基因的篩選。在段落，US2007/0204352A1提供顯著的程度的HSPC117基因的進化保守的背景，其蛋白可在本專利技術的方法中，在這些HSPCl 17分子的新功能的知識中使用。本專利技術的RNA連接酶可用于催化第IRNA轉移到第2RNA。兩個RNA末端可由連接酶連接。此連接通常是兩個RNA之間的磷酸二酯鍵的共價連接。尤其是，一個RNA可包含3’磷酸，尤其是以2’，3’ -環磷酸形式，及另一 RNA可包含5’ -OH末端。該端之間尤其是通過使用5’ -OH末端形成連接的能力是本專利技術的HSPC117分子的獨特特征。一般而言，RNA連接可為鏈間或鏈內連接。2個分離RNA鏈可分別在3’和5’端連接。此外，在鏈內連接中 ，連接一個RNA分子的5’和3’端。在本專利技術的進一步實施方式中，RNA是雙鏈。尤其是，由本專利技術的RNA連接酶連接的第I和/或第2RNA分子可包含雙鏈部分或是完全雙鏈或替代性地是單鏈。尤其優選的是，由RNA連接酶反應連接的其他RNA端的上述3’端以及5’末端可為雙鏈。RNA的，尤其是RNA剪接的其他部分也可為單鏈，通常有前-tRNA的單鏈3’懸伸。而且，由RNA連接酶反應連接的5’和/或3’端可為單鏈，如在前-tRNA加工中的通常情況。雙-鏈可為第I和第2RNA分子之間的堿基配對，或替代性地可為與其他RNA鏈的堿基配對。在尤其優選的實施方式中，本專利技術的HSPC117分子用于RNA剪接。在RNA剪接反應中，將由本專利技術的RNA連接酶連接的2外顯子之間的內含子部分移出。典型剪接反應是外顯子1-內含子-外顯子2序列到外顯子1-外顯子2的反應。其他剪接反應可移出幾個內含子，且任選地也移出這些內含子部分之間的外顯子。由HSPC117分子作為RNA連接酶的創造性使用連接的RNA可具有任何長度。例RNA長度是2 3000個核苷酸或堿基對長。在特定實施方式中，第IRNA或第2RNA可為多于 1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，40，45，50，60，70，80，90 或多于 100 個核苷酸或堿基對長。替代性地或此外，RNA，第IRNA或第2RNA或二者，可為達3000,2000，1500,1200，1000，900，800，700，600，500，400，300，200，100，80，70，60 或達 50 個核苷酸或堿基對長。本專利技術的HSPC117分子可具有下列之任一個:SEQ ID NO:1, SEQ 本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...

【專利技術屬性】
技術研發人員：J·波寶，S·威澤爾，J·馬蒂內，K·美希特勒，A·施勒費爾，
申請(專利權)人：分子生物技術院有限公司，
類型：
國別省市：