一種類輔脂酶2基因的干擾片段及其應用制造技術

本發明專利技術公開了一種類輔脂酶2（colipase-like2，Clpsl2）的干擾片段及其應用，屬于生物技術與醫藥領域。本發明專利技術檢測了Clpsl2mRNA和蛋白在附睪中的表達定位，發現Clpsl2在附睪頭部上皮細胞中合成，并分泌到管腔，與附睪管腔中的精子頭部的頂體和精子尾部的主段特異結合。公開了Clpsl2的干擾片段，其核苷酸序列為：5′-ACTCAGTGCTCCAGTGACTGT-3′，在小鼠附睪中通過該干擾片段敲低Clpsl2表達后小鼠附睪尾部的精子數量減少、精子運動力減弱，且與雌鼠交配后孕鼠的胚胎數減少，且多個胚胎發育不正常，在雄性小鼠避孕藥制備及在小鼠精子成熟相關藥物制備中應用。

【技術實現步驟摘要】
【專利摘要】本專利技術公開了一種類輔脂酶2（colipase-like2，Clpsl2）的干擾片段及其應用，屬于生物技術與醫藥領域。本專利技術檢測了Clpsl2mRNA和蛋白在附睪中的表達定位，發現Clpsl2在附睪頭部上皮細胞中合成，并分泌到管腔，與附睪管腔中的精子頭部的頂體和精子尾部的主段特異結合。公開了Clpsl2的干擾片段，其核苷酸序列為：5′-ACTCAGTGCTCCAGTGACTGT-3′，在小鼠附睪中通過該干擾片段敲低Clpsl2表達后小鼠附睪尾部的精子數量減少、精子運動力減弱，且與雌鼠交配后孕鼠的胚胎數減少，且多個胚胎發育不正常，在雄性小鼠避孕藥制備及在小鼠精子成熟相關藥物制備中應用。【專利說明】一種類輔脂酶2基因的干擾片段及其應用
本專利技術屬于生物技術與醫藥領域，特別涉及一種類輔脂酶2 (colipase-like2,Clpsl2)基因的干擾片段及其應用。
技術介紹
近幾年對人類的調查發現，男性精液質量和生殖力在逐步下降。據統計，在中國育齡夫婦中不孕不育的發病率為10-15%，其中男性因素占40%左右。臨床發現很多不孕不育病例與精子數量、密度、成熟(運動、獲能、頂體反應等)異常相關。另一方面，長期以來，避孕主要是針對育齡婦女，隨著國際人權條約的簽署，社會對男性避孕提出了倡導和要求，開發自主產權的男性避孕藥有利于中國在避孕藥市場上提高國際競爭力。附睪是男性生殖器官中的重要環節之一，是精子儲存、運輸、成熟的關鍵場所。精子運動能力的形成、頂體功能的完善、代謝類型的轉變、精卵的識別和融合等一系列程序化成熟功能的獲得都是在附睪微環境中完成的。附睪中特異表達的蛋白將有助于解決精子成熟異常引起的不育、不孕癥。同時由于附睪功能相對單一，干擾其功能的藥物不至于引起嚴重的副反應；其次，精子進入附睪前，分化已經完全，DNA復制及轉錄均停止，在這個階段藥物作用不會引起DNA遺傳病，因此附睪也是一個理想的避孕靶器官，而僅在附睪中表達的特異蛋白也成為男性避孕藥開發的理想靶點。本專利技術所涉及的Clpsl2為一個功能未知的附睪特異表達的基因，其mRNA主要在附睪頭部組織表達，且具有雄激素依賴性和時間特異性。目前僅有兩篇文章略略提及Clpsl2，其一為oh等(2006) 在對40個附睪特異表達基因的mRNA表達特性進行分析時包含這個基因(Mm.99400);中科院生化所張永蓮院士(2008)通過建庫分析人的附睪特異表達基因也發現了這個基因(con32)在附睪頭部和體部表達。在前期我們通過原核表達制備了小鼠Clpsl2包涵體蛋白作為抗原免疫家兔制備了多克隆抗血清，也通過融合表達系統制備了 Clpsl2的蛋白初步分析了其輔脂酶活性。但是目前對Clpsl2的表達定位及在附睪體內參與的生物學功能都不清楚，因此也限制了其開發使用。雖然對附睪特異的Clpsl2的相關工作沒有開展，但是已經有部分實驗室已經開始探索附睪中特異表達的基因及蛋白的功能，在國際上享有盛名的就包括中科院生化所張永蓮院士團隊。他們對一系列的附睪特異表達基因的特性及功能進行了初步研究，如研究發現LCN6表達于附睪起始部位的大部分的主細胞，與精子的頂體及中段結合，參與了精子運動能力的獲得(史毅，大鼠附睪特異性基因Lcn6的表達特性和功能研究，中國科學院研究生院上海生命科學研究院博士學位論文，2007)。同時也對部分附睪特異功能基因及蛋白申請了專利用于保護其所發現的附睪特異基因或者蛋白在精子成熟中的功能(CN1689640)或者保護制備調控雄性生育能力用的藥物中、開發男性避孕藥及制備診斷和治療雄性不育癥的藥物中的用途(專利申請號201010129861)。但目前雖然已對附睪中特異表達的部分基因及蛋白的功能解析，但用于雄性精液原因引起的不孕不育的診斷和治療，或者作為雄性避孕藥物設計的靶點開發相應的藥物都還處于設計階段。
技術實現思路
為克服上述現有技術的缺點和不足，本專利技術的目的在于提供一種類輔脂酶2(colipase_like2, Clpsl2)基因的干擾片段。本專利技術的另一目的在于提供上述類輔脂酶2基因的干擾片段的用途。本專利技術的目的通過下述的技術方案實現:一種類輔脂酶2 (Clpsl2)基因的干擾片段，其核苷酸序列為:RNA1-Nol:5' -ACTCAGTGCTCCAGTGACTGT-3'。所述的類輔脂酶2 (Clpsl2)基因的干擾片段，能夠引起小鼠精子數量減少、精子的運動性能減弱和精子活性的降低，在雄性小鼠避孕藥制備及在小鼠精子成熟相關藥物制備中應用。【專利附圖】【附圖說明】圖1為Clpsl2mRNA在附睪組織中的原位雜交表達定位分析圖；Clpsl2蛋白在附睪頭部特異的表達，在附睪體、附睪尾及睪丸中無表達；途中深黑色表示Clpsl2的陽性表達信號。圖2為Clpsl2蛋白在附睪組織區段性蛋白印跡檢測分析圖；Clpsl2蛋白在附睪頭部特異的表達，在附睪體、附睪尾及睪丸中無表達。圖3為Clpsl2蛋白在附睪組織切片中的免疫組化分析圖；上圖為Clpsl2在整個附睪中的表達分布，且對應的A-D分別表示，A附睪頭近側端；B，附睪頭遠側端；C附睪體，D附睪尾，E為附睪頭部近側端(A)局部放大圖，F為陰性血清對照，箭頭標示Clpsl2陽性表達部位。圖4為Clpsl2蛋白在附睪管腔區段濃度梯度分布的間接免疫熒光分析圖；上圖是附睪示意圖，A-H標示所拍攝的附睪組織的部位，A'、E'、G'和H'表示對應部位的陰性血清對照，Clpsl2用Cy3紅色熒光標記，圖中管腔中高亮信號為Clpsl2表達信號；而細胞核用DAPI染色，圖中管壁細胞可見DAPI信號。圖5為Clpsl2蛋白與附睪管腔精子結合的間接免疫熒光分析圖；Clpsl2用Cy3紅色熒光標記，而細胞核用DAPI染色，可見Clpsl2在附睪頭和附睪體的精子的頭部頂體和尾部主段結合，附睪尾的精子與Clpsl2較附睪頭/體部位弱且少。圖6為慢病毒介導的RNAi敲低小鼠附睪中Clpsl2表達的蛋白印跡檢測圖；Clpsl2的表達用抗Clpsl2的抗血清進行檢測，GAPDH為內參對照。圖7為慢病毒介導的RNAi敲低小鼠附睪中Clpsl2表達后的與雌鼠合籠后的胚胎檢測圖；敲低Clpsl2表達后，7天后與雌鼠交配，合籠后14天觀察胚胎變化，RNA1-N0.1靶標包裝的慢病毒敲低Clpsl2表達后,胚胎數量減少,有多個不正常的胚胎；RNA1-N0.2革巴標包裝的慢病毒敲低Clpsl2表達后胚胎數量沒有明顯差別，但胚胎發育遲緩。【具體實施方式】下面結合實施例及附圖對本專利技術作進一步詳細的描述，但本專利技術的實施方式不限于此。本專利技術所選擇的KM小鼠購買于廣東省實驗動物中心，許可證號SCXK (粵)2008-0002。上述本專利技術采用的慢病毒由上海吉瑪制藥技術有限公司包裝。實施例1:原位雜交檢測Clpsl2mRNA在附睪組織中的表達定位用ApaI將含有Clpsl2基因的pGEM-T-Clpsl2載體(關藝青，禹艷紅，黃丹，潘善培.小鼠附睪特異性輔脂酶的原核表達及其抗體的制備.暨南大學學報(自然科學與醫學版)，2010，31 (2): 105-110.)質粒線性化，酚氯仿純化后用Roche的地高辛探針標記試劑盒，通過SP6RNA聚合酶標記反義探針，以T7R本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種類輔脂酶2基因的干擾片段，其特征在于核苷酸序列為：5′?ACTCAGTGCTCCAGTGACTGT?3′。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：禹艷紅，陳雷，曹佐武，蔡冬青，廉滋珍，秦俊文，齊緒峰，武征，
申請(專利權)人：暨南大學，
類型：發明
國別省市：