一種檢測LBP基因標簽單核甘酸多態(tài)性位點的方法及試劑盒技術

本發(fā)明專利技術屬于分子生物學領域，具體涉及檢測LBP基因標簽單核甘酸多態(tài)性位點的方法及試劑盒，該方法包括步驟：1）設計特異性擴增引物和測序引物；2）用特異性擴增引物對待測標本的DNA進行PCR擴增；3）用焦磷酸測序法進行測序。本發(fā)明專利技術的方法及試劑盒能夠實現(xiàn)快速、簡便、準確、高效、實用、經濟的檢測LBP基因標簽SNP基因型，能夠滿足臨床檢驗實際工作的需要，利于LBP基因標簽SNP檢測預測疾病的發(fā)生、發(fā)展風險。

【技術實現(xiàn)步驟摘要】
—種檢測LBP基因標簽單核甘酸多態(tài)性位點的方法及試劑jm
本專利技術屬于分子生物學領域，具體涉及適用于PCR擴增結合焦磷酸測序技術檢測LBP基因標簽單核甘酸多態(tài)性位點的方法及試劑盒。
技術介紹
1986年Tobias首次從兔血清中分離、純化出脂多糖結合蛋白(Lipopolysaccharide binding protein, LBP)，LBP 屬于 I 型急性期反應蛋白，人 LBP 蛋白由481個氨基酸組成，并且有分泌性蛋白典型的25個氨基酸組成的信號肽。LBP蛋白相對分子質量為60ku，蛋白質部分是由一條50ku的單鏈多肽組成，其血漿濃度為2~7mg/L，在LPS誘導急性反應后，血漿LBP濃度可明顯提高。LBP主要在肝臟合成，有研究表明，肺、腸、腎、脾等肝外組織也合成LBP，其中肺是肝外組織LBP mRNA表達量最多的器官。在急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)患者的支氣管肺泡灌洗液中，LBP濃度是正常人的64倍。LBP不僅是一種血漿蛋白，還可作為ー種跨膜蛋白。這種膜結合LBP本身可嵌入單核細胞的胞膜中，同時促進脂多糖(LPS)嵌入其中，抗LBP單克隆抗體并不抑制LBP的嵌入，但是可抑制LPS的嵌入及LPS誘導的TNF- a的產生，因此膜結合LBP和LPS的嵌入被認為是LBP介導LPS激活單核細胞的ー個重要步驟。單核甘酸多態(tài)性(SNP)是指染色體上單個核苷酸變異引起的群體中DNA序列多態(tài)性，具有密度高、遺傳穩(wěn)定、易于自動化分析等特點，被認為是繼限制性片段長度多態(tài)性、微衛(wèi)星多態(tài)性之后的第三代遺傳標記，可用于基因定位、多態(tài)性分析等方面，是研究疾病遺傳易感性、疾病診斷、藥物篩選等的常用指標。LBP基因標簽單核甘酸多態(tài)性位點的檢測與分型，對LBP基因在健康人群的遺傳特點及與疾病發(fā)生、發(fā)展的遺傳關聯(lián)研究有重要意義。關于SNP的檢測方法，目前已發(fā)展了 20余種，如直接測序法、探針雜交法、飛行質譜分析法、限制性片段長度多態(tài)性分析法等，但因這些方法的費用、準確性和適用規(guī)模等方面的缺點，局限了基因多態(tài)性與疾病發(fā)生、發(fā)展和預后的遺傳關聯(lián)研究。而焦磷酸測序技術是新一代基于酶級聯(lián)反應的DNA序列分析技木，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶4種酶的協(xié)同作用下，將DNA單鏈上的每ー個dNTP聚合與一次熒光信號釋放偶聯(lián)起來，通過檢測熒光的釋放和強度，達到實時測定DNA序列的目的。該技術具有其獨特的優(yōu)勢，無需電泳、DNA片段無需熒光標記；具有操作簡便、檢測成本低、所需樣品量小、快捷、準確、高通量、靈敏度高等特點，符合臨床大樣本檢測要求。
技術實現(xiàn)思路
有鑒于此，本專利技術的目的之ー在于提供一種檢測LBP基因標簽單核甘酸多態(tài)性位點的方法，其能夠 簡捷、直觀、準確的對LBP標簽SNP基因型進行檢測和判讀。為實現(xiàn)上述目的，本專利技術的技術方案為:檢測LBP基因標簽單核甘酸多態(tài)性位點的方法，包括以下步驟:I)特異性引物的設計:根據(jù)被證實的LBP基因標簽單核甘酸多態(tài)性位點，設計特異性擴增引物和測序引物，其中，所述特異性擴增引物中的一條用生物素標記；2)PCR擴增:以待測標本的DNA為模板，用步驟I)所述的特異性擴增引物進行PCR反應，得PCR擴增物；3)焦磷酸測序:將步驟2)所得PCR擴增物采用堿變性使其分開成單鏈，取其中被生物素標記的單鏈PCR擴增產物純化后，與步驟I)所述測序引物進行雜交反應，并分析結果以判斷所述待測標本的靶單核甘酸是否具備多態(tài)性。本技術方案的創(chuàng)新點主要在首次采用焦磷酸測序法檢測LBP基因的單核甘酸多態(tài)性。進一歩，所述LBP基因標簽單核甘酸多態(tài)性位點包括:rsl780623、rsll536972和rs2232618中的ー個或多個。上述位點是通過如下方法獲得的:利用HapMap (http://www.hapmap.0rg) SNP 數(shù)據(jù)庫(HapMap Data Rel 28 Phase II+III, AuglO, on NCBI B36assembly, dbSNP bl26)下載LBP基因及其上下游IOkb范圍內中國北京漢族人群(CHB)SNP數(shù)據(jù):1)檢索框輸入基因名查看各基因在HapMap定位，并上下游各延伸10kb，2)“Reports&Analysis” 的選項中選擇:Download SNP genotype data。3) “config” 中選擇中國北京漢族人群(Chinese Han Bei jing，CHB)，獲取中國北京漢族人群SOCS家族各基因及其延伸區(qū)域內所有SNP位點。進ー步，所述rsl780623位點的上游擴增引物的核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示，下游擴增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，測序引物如SEQ ID NO:3所示；所述rsll536972位點的上游擴增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，下游擴增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，測序引物如SEQ ID NO:6所示；所述rs2232618位點的上游擴增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，下游擴增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示，測序引物如SEQ ID NO:9所示。詳見下表:本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術保護點】
檢測LBP基因標簽單核甘酸多態(tài)性位點的方法，其特征在于：包括以下步驟：1）特異性引物的設計根據(jù)被證實的LBP基因標簽單核甘酸多態(tài)性位點，設計特異性擴增引物和測序引物，其中，所述特異性擴增引物中的一條用生物素標記；2）PCR擴增以待測標本的DNA為模板，用步驟1）所述的特異性擴增引物進行PCR反應，得PCR擴增物；3）焦磷酸測序將步驟2）所得PCR擴增物采用堿變性使其分開成單鏈，取其中被生物素標記的單鏈PCR擴增產物純化后，與步驟1）所述測序引物進行雜交反應，并分析結果以判斷所述待測標本的靶單核甘酸是否具備多態(tài)性。

【技術特征摘要】
1.檢測LBP基因標簽單核甘酸多態(tài)性位點的方法，其特征在于:包括以下步驟: 1)特異性引物的設計 根據(jù)被證實的LBP基因標簽單核甘酸多態(tài)性位點，設計特異性擴增引物和測序引物，其中，所述特異性擴增引物中的一條用生物素標記； 2)PCR擴增 以待測標本的DNA為模板，用步驟I)所述的特異性擴增引物進行PCR反應，得PCR擴增物； 3)焦磷酸測序 將步驟2)所得PCR擴增物采用堿變性使其分開成單鏈，取其中被生物素標記的單鏈PCR擴增產物純化后，與步驟I)所述測序引物進行雜交反應，并分析結果以判斷所述待測標本的靶單核甘酸是否具備多態(tài)性。2.根據(jù)權利要求1所述的檢測LBP基因標簽單核甘酸多態(tài)性位點的方法，其特征在于:所述LBP基因標簽單核甘酸多態(tài)性位點包括:rsl780623、rsl 1536972和rs2232618中的一個或多個。3.根據(jù)權利要求2所述的檢測LBP基因標簽單核甘酸多態(tài)性位點的方法，其特征在于:所述rsl780623位點的上游擴增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，下游擴增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，測序引物如SEQ ID NO:3所示；所述rsll536972位點的上游擴增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，下游擴增引物的核苷酸序列如SEQ IDNO:5所示，測序引物如SEQ ID NO:6所示；所述rs2232618位點的上游擴增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，下`...

【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：曾靈，蔣建新，張安強，王海燕，杜娟，顧瑋，岳彩黎，
申請(專利權)人：中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學第三附屬醫(yī)院，
類型：發(fā)明
國別省市：