本發明專利技術涉及一種利用雄蕊瓣化標記不結球白菜雄性不育基因的方法，屬于生物技術領域，用于不結球白菜雄性不育系的分子標記輔助選擇育種。用標記引物AFLP17，或者用標記引物SCAR33，擴增由雄蕊瓣化品系及其保持系RNA反轉錄合成的DNA，如果能夠擴增出300bp的片段，就標志著不結球白菜雄性不育基因的存在。本發明專利技術對不結球白菜雄蕊瓣化品系W053及其保持系W052?RNA反轉錄合成的DNA進行cDNA-AFLP及SCAR分子標記的篩選，可有效開展不結球白菜雄性不育系的分子標記輔助選育，大大提高選擇效率，從而加快育種進程。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術公開了，屬于生物
，用于不結球白菜雄性不育系的分子標記輔助選擇育種。
技術介紹
近年來，不結球白菜(Brassicacampestris L. ssp. chinensis Makino)的需求量不斷增長，但其具有不耐儲運的特性，且品種較為單一。這就使雜種優勢利用的重要性日益突顯，通過雜交獲得具有優質、豐產、抗逆性強的不結球白菜品種。目前，廣泛用于配制雜交種的途徑主要有自交不親和系、化學殺雄和雄性不育系等，但是前兩種途徑分別在工作量和效果方面具有很大的缺陷。因此，雄性不育系的利用成為當前雜種優勢利用的首選途徑。通常情況下，無論是細胞質雄性不育(CMS)還是細胞核雄性不育(GMS)，大都表 現雄蕊退化引起的不能產生花粉或不產生有活性花粉的雄性不育類型，其雄性器官雖然退化、畸形，但仍然殘存(俞咪娜，2008)。然而，雄蕊瓣化突變體表現為花瓣錯位表達于雄蕊位置以致雄蕊消失，雌雄兩性花變成無雄蕊的單性雌花，由此產生的雄性不育穩定、徹底，是一種新的雄性不育類型，為雄性不育機理的研究提供了很好的材料，同時也豐富了現有不結球白菜雄性不育的類型(張彥鋒，2010)。因此，預測以這一新品系為材料獲得的差異基因與雄性不育性狀的相關度會更高。雄蕊瓣化同源異型突變多見于模式植物擬南芥，農作物中也有報道，陸光遠等(2005)在甘藍型油菜、芥菜型油菜、蘿卜等材料中發現雄蕊瓣化突變體。對于這類突變材料的研究大都集中在花發育的機理方面，而利用它調取雄性不育相關基因的研究卻不多見。本試驗以白菜雄蕊瓣化品系W053及其保持系W052為材料，在試驗初期，我們發現W053常出現雄蕊缺失，花瓣增多的現象，且該特性具有相對穩定的遺傳性。傳統的育種方法選育不育系周期長、效率低，這也是目前限制白菜雄性不育系選育和應用的重要應用。分子標記輔助選擇不受環境條件的限制，可實現苗期選擇，減少工作量，加速育種進程，提高白菜不育系的育種效率。隨著分子生物學的發展，國內外都很重視開展基因組中育性基因的分子標記篩選以及分子標記輔助選擇。在蔬菜作物上，吳國平等(2012)利用SRAP技術，在甜椒胞質雄性不育恢復系中篩選獲得了 I個與育性恢復基因緊密連鎖的分子標記。黃鎮(2009)利用AFLP技術，在甘藍型油菜中獲得了 5個育性相關基因，并成功轉化為SCAR標記，同時建立了甘藍型油菜隱形細胞核雄性不育系的分子標記輔助選擇方法。張慧(2010)利用SRAP和SSR技術，在大白菜中篩選獲得了 5個雄性不育相關基因，并成功轉化為更為穩定的SCAR標記。李婧婧等(2012)利用AFLP技術，在甘藍型油菜隱性上位細胞核雄性不育兩型系中獲得了 7個與esp基因緊密連鎖的分子標記。cDNA-AFLP技術的應用目前已經非常廣泛且成熟，主要是針對基因差異表達分析方面的。本試驗以不結球白菜雄蕊瓣化品系W053及其保持系W052為材料，利用該技術，優化cDNA-AFLP各反應體系，獲得兩個材料間具有多態性的片段，對這些基因進行生物信息學的分析，設計引物將差異基因轉化為更為穩定的SCAR標記，最終獲得雄性不育相關基因。目前還沒有以不結球白菜雄蕊瓣化這一新品系為材料，通過這項技術進行基因差異表達分析，進而獲得雄性不育相關基因的成功報導。
技術實現思路
技術問題本專利技術的目的篩選出一個或幾個與不結球白菜雄性不育基因緊密連鎖的分子標記，建立不結球白菜雄性不育系分子標記輔助選擇體系，從而提高不結球白菜雄性不育系的選擇效率，為雜種優勢的利用提供理想材料。 技術方案I、，其特征在于用標記引物AFLP17，左端引物序列GACTGCGTACCAATTCAGC,右端引物序列:GATGAGTCCTGAGTAATGC :或者用標記引物 SCAR33，左端引物序列CTGAGTAATCGGGCATGCAA，右端引物序列GTAATCGCAGCCCAGACAAC。擴增由雄蕊瓣化品系及其保持系RNA反轉錄合成的DNA，如果能夠擴增出300bp的片段，則標志著不結球白菜雄性不育基因的存在；2、根據權利要求I所述的一種利用雄蕊瓣化標記不結球白菜雄性不育基因的的方法，其中采用的AFLP17和SCAR33兩種分子標記引物是通過以下方法篩選獲得的I)選用不結球白菜雄蕊瓣化品系W053及其保持系W052 ；2)用于篩選標記引物的DNA模板的制備提取植物組織總RNA并反轉錄合成雙鏈DNA，按照相應試劑盒內附說明書進行操作；利用識別序列分別6bp和4bp的限制性內切酶EcoRI和MseI將雙鏈DNA酶切并加上適宜的接頭，酶切體系 20 μ 1，其中 10XNEB 2 μ I, DNA 2 μ 1,100XBSAO. 2 μ I, ECORI-HFO.5μ 1，MSEI0. 5μ 1，加ddH20至20μ 1，37°C反應3h，再將該20 μ I產物加入到預先混好的 5μ I 連接體系中，包括 Τ4 Iigase O. 5μ 1,10ΧΤ4 ligase buffer O. 5 μ I, MseIadapter 0.5 μ I, EcoRI-HF adapter 0. 5 μ I,IOmMATP 0.5 μ I, dd H2O 2· 5 μ 1,16 °C 過夜；使用相應的引物進行預擴增獲得大量的模板，20 μ I體系，其中DNA連接產物5 μ 1，EcoR primer(GACTGCGTACCAATTC)3 μ 1，Mse primer(GATGAGTCCTGAGTAA)3 μ 1,2. 5mM dNTP2μ 1,5U rTaq 0. 25 μ 1,10 X buffer (Mg2+) 2 μ I, ddH20 4. 75 μ 1，產物稀釋后用于選擇性擴增；3)標記引物的篩選使用64對選擇性擴增引物進行PCR反應，體系為20 μ 1，其中模板2 μ 1，左端引物 I μ I，右端引物 I μ 1，10XPCR buffer (Mg2+free) 2 μ I, dNTP (2. 5mM) I. 6 μ I, Mg2+L 2 μ 1，5U rTaq O. 2 μ 1，加ddH20至20 μ I ;PCR反應程序為94°C預變性2min，第一輪擴增參數94°C 30s, 65°C 30s, 72°C 45s，12輪循環，每輪循環溫度遞減O. 7°C。第二輪擴增參數940C 30s, 56°C 30s, 72°C 45s，重復23個循環，最后72°C延伸5min ;PCR產物于6%的變性聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳分離分析，電泳結束后通過銀染法顯示條帶，篩選出在雄蕊瓣化品系W053及其保持系W052間的多態性片段，從而獲得白菜雄性不育基因的I個300bp的AFLP標記片段，其標記引物為AFLP17 ；4)差異片段的回收、克隆及測序將差異條帶用潔凈的刀片刮下來，置于滅過菌的I. 5ml離心管內，加入IOOu I的dd H20，在沸水中煮30分鐘，冷卻至室溫后取2 Ul用做模板，使用預擴增引物進行PCR擴增，然后瓊脂糖凝膠電泳檢測，切下含有目的條帶的瓊脂糖凝膠塊，按照瓊脂糖凝膠回收試劑盒內附方案進行DNA的回收與純化；將回收得到的DNA與PMD18-T載體進行連接，IOii I 體系，包括 pMD 18-T Vector lul, 本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種利用雄蕊瓣化標記不結球白菜雄性不育基因的方法，其特征在于：用標記引物AFLP17，左端引物序列：GACTGCGTACCAATTCAGC，右端引物序列：GATGAGTCCTGAGTAATGC；或者用標記引物SCAR33，左端引物序列：CTGAGTAATCGGGCATGCAA，右端引物序列：GTAATCGCAGCCCAGACAAC。擴增由雄蕊瓣化品系及其保持系RNA反轉錄合成的DNA，如果能夠擴增出300bp的片段，則標志著不結球白菜雄性不育基因的存在。
【技術特征摘要】
1.一種利用雄蕊瓣化標記不結球白菜雄性不育基因的方法，其特征在于用標記引物 AFLP17，左端引物序列GACTGCGTACCAATTCAGC，右端引物序列GATGAGTCCTGAGTAATGC ；或者用標記引物SCAR33，左端引物序列CTGAGTAATCGGGCATGCAA，右端引物序列GTAATCGCAGCCCAGACAAC。擴增由雄蕊瓣化品系及其保持系RNA反轉錄合成的DNA，如果能夠擴增出300bp的片段，則標志著不結球白菜雄性不育基因的存在。2.根據權利要求I所述的一種利用雄蕊瓣化標記不結球白菜雄性不育基因的方法，其中采用的AFLP17和SCAR33兩種分子標記引物是通過以下方法篩選獲得的 1)選用不結球白菜雄蕊瓣化品系W053及其保持系W052； 2)用于篩選標記引物的DNA模板的制備 提取植物組織總RNA并反轉錄合成雙鏈DNA，利用識別序列分別6bp和4bp的限制性內切酶EcoRI和MseI將雙鏈DNA酶切并加上適宜的接頭，使用相應的引物進行預擴增獲得大量的模板，產物稀釋后用于選擇性擴增； 3)標記引物的篩選 使用64對選擇性擴增引物進行PCR反應，體系為20μ 1，其中模板2μ 1，左端引物I μ 1，右端引物 I μ 1，IOXPCR buffer (Mg2+free) 2 μ 1，dNTP (2. 5mM) I. 6μ I, Mg2+L 2 μ 1，5U rTaq O. 2 μ 1，加ddH20至20 μ I ;PCR反應程序為94°C預變性2min，第一輪擴增參數94°C 30s, 65°C 30s, 72°C 45s，12輪循環，每輪循環溫度遞減O. 7°C。第二輪擴增參數940C 30s, 56...
【專利技術屬性】
技術研發人員：胡春梅，李樹燕，
申請(專利權)人：南京農業大學，
類型：發明
國別省市：
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