本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種檢測急性淋巴細(xì)胞性白血病的基因探針組合物及試劑盒，該基因探針組合物包括TEL基因探針，AML1基因探針，PAX5基因探針，P16基因探針和IKZF1基因探針。本發(fā)明專利技術(shù)的另一目的是提供了一種急性淋巴細(xì)胞性白血病熒光原位雜交檢測試劑盒，該試劑盒包括上述基因探針組合物。本發(fā)明專利技術(shù)試劑盒可對同一樣本甚至白血病單個細(xì)胞進(jìn)行5種基因的同時檢測，顯著提高了檢測能力和效率。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及一種基因探針組合物及試劑盒，尤其涉及一種檢測急性淋巴細(xì)胞性白血病的基因探針組合物及試劑盒。
技術(shù)介紹
急性淋巴細(xì)胞性白血病是一種惡性程度很高的血液疾病，其特征為外周血中存在大量的類似于淋巴母細(xì)胞的未成熟白細(xì)胞，這些異常細(xì)胞也可在骨髓，淋巴結(jié)，脾臟和其它器官中發(fā)現(xiàn)。急性淋巴細(xì)胞白血病在兒童急性白血病中約占80%，發(fā)病率高峰在3歲至7 歲之間，該病也可發(fā)生于成年人，約占所有成年白血病的20%。在急性白血病中，惡性細(xì)胞失去成熟和定向分化的功能，惡變細(xì)胞迅速分裂并取代正常細(xì)胞。當(dāng)惡性細(xì)胞取代正常的骨髓成分時即發(fā)生骨髓衰竭，由于正常細(xì)胞的數(shù)目急劇減少，患者變得容易出血和感染。目前，急性淋巴細(xì)胞性白血病的發(fā)病原因仍不清楚。輻射、某些毒素，如苯和一些化學(xué)試劑，可能和該病的誘發(fā)有關(guān)。近年來分子生物學(xué)的研究表明，染色體和某些基因的異變在急性淋巴細(xì)胞性白血病的發(fā)生過程中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用。例如TEL/AM1基因融合是由t(12 ；21)染色體易位引起的。這種基因重排最常見于B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞性白血病，熒光原位雜交法的檢出率為21%，而常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)的檢出率僅為O. 05%。這種基因易位有較好的預(yù)后，但可能有復(fù)發(fā)。TEL基因在兒童急性淋巴細(xì)胞白血病中常有缺失，雖然在細(xì)胞遺傳學(xué)上不可見，但可引起12pl2-13的雜合子缺失(LOH)。這個缺失和TEL/AM1易位有關(guān)。 TEL和AMLl基因均編碼轉(zhuǎn)錄因子，但TEL在骨髓造血中是必需的。TEL/AML1易位引起幾乎完整的AMLl蛋白和TEL的一部分相融合，是引發(fā)急性淋巴細(xì)胞性白血病的原因之一。PAX5也是一種轉(zhuǎn)錄因子。PAX5編碼B淋巴細(xì)胞特異的激活蛋白，在淋巴細(xì)胞分化的早期表達(dá)，該蛋白在淋巴細(xì)胞分化早期具有重要調(diào)節(jié)作用。PAX5基因位于染色體9pl3區(qū)域。T(9 ；14) (pl3 ；q32)易位引起的PAX5基因轉(zhuǎn)錄異常，會引起淋巴瘤。P16基因位于染色體9p21。而9p21的缺失存在大量腫瘤之中包括10%的兒童急性淋巴細(xì)胞性白血病病人，并且其發(fā)病率在T細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞性白血病中更高。這一區(qū)域有很多研究，發(fā)現(xiàn)熒光原位雜交法檢出9p21缺失的兒童急性淋巴細(xì)胞白血病中的90% 含有抑癌基因P16(CDKN2A)的缺失。該基因抑制CDK4和CDK6兩個激酶，控制細(xì)胞周期從 Gl到S期的轉(zhuǎn)換。這一細(xì)胞周期控制功能的破壞引起突變細(xì)胞的增值。IKZFl (Ikaros family zinc finger protein I)是一種具有鋒指結(jié)構(gòu)的重要的人體蛋白質(zhì)。IKZFl在造血系統(tǒng)中具有極其重要的功能，它的缺失可引發(fā)淋巴細(xì)胞性白血病。 近年來的研究表明IKZFl是一種抑癌基因，該基因的缺失和急性B淋巴細(xì)胞性白血病的發(fā)病密切相關(guān)。最近的研究發(fā)現(xiàn)，在費城染色體陽性的急性淋巴細(xì)胞性白血病的發(fā)生和慢性髓性白血病的急淋變過程中，包括IKZFl基因缺失在內(nèi)的其他遺傳學(xué)改變與BCR-ABLl易位起了協(xié)同作用。綜上所述，TEL, AMLI, PAX5，P16和IKZFl這5種基因和急性淋巴細(xì)胞白血病的發(fā)生有著密切的關(guān)系。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)所要解決的技術(shù)問題是提供一種檢測急性淋巴細(xì)胞性白血病的基因探針組合物及試劑盒，可以用于確定急性淋巴細(xì)胞性白血病的分子病理類型，判斷病情預(yù)后，指導(dǎo)個體化治療，評估臨床治療效果，監(jiān)測病灶復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。為了解決上述問題，本專利技術(shù)采用的技術(shù)方案為本專利技術(shù)提供了一種檢測急性淋巴細(xì)胞性白血病的基因探針組合物，包括TEL基因探針，AMLl基因探針，PAX5基因探針，P16基因探針和IKZFl基因探針。優(yōu)選地，所述的基因探針組合物包括TEL 基因探針RP11-654E9(UCSC genome browser)；AMLl 基因探針RP11-77G18(UCSC genome browser)；PAX5 基因探針RP11-243F8(UCSC genome browser)；P16 基因探針RP11-97A22(UCSC genome browser)；IKZFl 基因探針RPl 1-663L2(UCSC genome browser) 上述基因探針組合物中所涉及的基因探針均為經(jīng)過熒光素標(biāo)記的探針。根據(jù)本專利技術(shù)一個優(yōu)選的實施方案，TEL、AML1、PAX5、P16、IKZFl單個基因探針制備步驟如下I)、克隆篩選檢索UCSC genome browser,NCBI Clone Registry,Ensembl Genome Browser等數(shù)據(jù)庫分別含TEL，AMLl，PAX5，P16，IKZFl基因的所有克隆，并對這些克隆進(jìn)行篩選，選擇最佳的克隆；2)、克隆培養(yǎng)和鑒定按照篩選確定的克隆編號購買BAC克隆(美國Invitrogen 公司)，取5-10微升克隆菌液加到3-5毫升含氯霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振搖活化培養(yǎng)8-16小時；然后將菌液全部加入至400-500毫升含氯霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中， 37°C震搖培養(yǎng)8-16小時d#TEL、AMLl、PAX5、P16、IKZFl的BAC克隆用相對應(yīng)的基因引物進(jìn)行多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增，用1-2%的瓊脂糖凝膠電泳對產(chǎn)物進(jìn)行分析，從而完成待選克隆的分子鑒定；3)、基因探針的制備和驗證對多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)鑒定陽性的菌液，進(jìn)行質(zhì)粒制備； 用ND-1000超微量分光光度計對質(zhì)粒進(jìn)行濃度和純度(260nm/280nm)測定；采用缺口平移的方法對質(zhì)粒DNA進(jìn)行突光標(biāo)記，(選擇最佳的突光染料和鏡檢的突光顯微鏡的濾光片匹配組合，使檢測到的熒光信號強度最大)；對標(biāo)記產(chǎn)物進(jìn)行沉淀和濃縮；將熒光標(biāo)記的探針溶于含有50%去離子甲酰胺的雜交緩沖液中，-20° C避光，儲存，采用正常人外周血單個核細(xì)胞甩片進(jìn)行探針鑒定。根據(jù)本專利技術(shù)一個優(yōu)選的實施方案，TEL、AML1、PAX5、P16、IKZFl基因探針組合物的制備步驟如下I)、克隆篩選檢索UCSC genome browser,NCBI Clone Registry,Ensembl Genome Browser等數(shù)據(jù)庫分別含有TEL，AMLl，PAX5，P16、IKZFl基因的所有細(xì)菌人工染色體(BAC) 克隆，并對這些克隆進(jìn)行多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)鑒定，選出最佳的克隆。2)、克隆培養(yǎng)和鑒定按照篩選確定的克隆編號購買BAC克隆(美國Invitrogen 公司)，取5-10微升克隆菌液加到3-5毫升含氯霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振搖活化培養(yǎng)8-16小時；然后將菌液全部加入至400-500毫升含氯霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中， 37°C震搖培養(yǎng)8-16小時；對TEL、AMLl、PAX5、P16、IKZFl的BAC克隆用相對應(yīng)的基因引物進(jìn)行多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增，用1-2%的瓊脂糖凝膠電泳對產(chǎn)物進(jìn)行分析，從而完成待選克隆的分子鑒定。3)、基因探針的制備和鑒定獲得目的基因的克隆后，提取大量DNA，酶切DNA后采用缺口平移的方法對酶切后的DNA進(jìn)行熒光素標(biāo)記，再對TEL，AML1，PAX5，P16和IKZFl基因探針組合后進(jìn)行沉淀和濃縮，將制作好的探針組合物溶解到含有50%去離子甲酰胺的雜交緩沖液中，即得熒光標(biāo)記探針組雜交混合液，采用正常人外周血單個核細(xì)胞甩片進(jìn)行探針鑒定。根據(jù)本專利技術(shù)一個優(yōu)越的實施方本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點】
一種檢測急性淋巴細(xì)胞性白血病的基因探針組合物，其特征在于：該基因探針組合物包括TEL基因探針，AML1基因探針，PAX5基因探針，P16基因探針和IKZF1基因探針。
【技術(shù)特征摘要】
1.一種檢測急性淋巴細(xì)胞性白血病的基因探針組合物，其特征在于該基因探針組合物包括TEL基因探針，AMLl基因探針，PAX5基因探針，P16基因探針和IKZFl基因探針。2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的基因探針組合物，其特征在于所述基因探針組合物包括 TEL 基因探針RP11-654E9(UCSC genome browser)； AMLl 基因探針RP11-77G18(UCSC genome browser)； PAX5 基因探針RP11-243F8(UCSC genome browser)； P16 基因探針RP11-97A22(UCSC genome browser)；IKZFl 基因探針RPl 1-663L2(UCSC genome browser) 3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的基因探針組合物，其特征在于所述TEL基因探針、AMLl基因探針、PAX5基因探針、P16基因探針和IKZFl基因探針均為經(jīng)過熒光素標(biāo)記的探針。4.權(quán)利要求1-3任一項所述基因探針組合物的制備方法，其特征在于包括如下步驟 1)、克隆篩選檢索UCSC genome browser, NCBI Clone Registry, Ensembl GenomeBrowser數(shù)據(jù)庫分別含有TEL、AML1、PAX5、P16、IKZFl基因的所有細(xì)菌人工染色體(BAC)克隆，并對這些克隆進(jìn)行篩選，選出最佳的克隆； 2)、克隆培養(yǎng)和鑒定按照篩選確定的克隆編號購買BAC克隆(美國Invitrogen公司)，取5-10微升克隆菌液加到3-5毫升含氯霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振搖活化培養(yǎng)8-16小時；然后將菌液全部加入至400-500毫升含氯霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37°C震搖培養(yǎng)8-16小時；對TEL、AML1、PAX5、P16、IKZFl的BAC克隆用相對應(yīng)的基因引物進(jìn)行多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增，用1-2%的瓊脂糖凝膠電泳對產(chǎn)物進(jìn)行分析，從而完成待選克隆的分子鑒定； 3)、基因探針的制備和鑒定獲得目的基因的克隆后，提取大量DNA，酶切DNA后采用缺口平移的方法對酶切后的DNA進(jìn)行熒光素標(biāo)記，再對TEL，AML1，PAX5，P16和IKZFl基因探針組合后進(jìn)行沉淀和濃縮，將制作好的探針組合物溶解到含有50%去離子甲酰胺的雜交緩沖液中，即得熒光標(biāo)記探針組雜交混合液，采...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：程濤，竺曉凡，胡林萍，張麗，繆為民，
申請(專利權(quán))人：中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院血液學(xué)研究所，
類型：發(fā)明
國別省市：
還沒有人留言評論。發(fā)表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。