一種WFDC-2基因的原位雜交檢測試劑盒及其檢測方法和應用技術

本發明專利技術涉及一種WFDC-2基因(附睪蛋白4-HE4)的mRNA原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針、標記物，所述的雜交探針序列是WFDC-2基因的一段堿基。本發明專利技術還提供了一種WFDC-2基因mRNA原位雜交檢測方法。另外，本發明專利技術還提供了試劑盒在制備檢測卵巢癌疾病藥物中的應用。本發明專利技術優點在于：卵巢癌變前期篩查WFDC-2基因的mRNA表達量，做到早期的預防性篩查。本發明專利技術提供的試劑盒具有靈敏度高、特異性強的特點。本發明專利技術的檢測方法操作方便、簡單，能在醫院普遍使用和推廣。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種試劑盒，具體地說關于一種WFDC-2基因的原位雜交檢測試劑盒及其檢測方法和應用。
技術介紹
卵巢癌是女性生殖器官常見的腫瘤之一，發病率僅次于子宮頸癌和子宮體癌而列居第三位。但因卵巢癌致死者，卻占各類婦科腫瘤的首位，對婦女生命造成嚴重威脅。由于卵巢的胚胎發育，組織解剖及內分泌功能較復雜它所患的腫瘤可能是良性或惡性。因卵巢癌臨床早期無癥狀，鑒別其組織類型及良惡性相當困難，其發病隱匿，約75%的患者就診時已為中晚期，預后較差，其病死率居婦科惡性腫瘤之首。由于缺乏特異性臨床癥狀，僅有19%的卵巢癌患者是在腫瘤外侵前得到診斷及有效治療。在過去20年間，雖然卵巢癌的治療手段取得了進步，卻未明顯提高卵巢癌的治愈率，卵巢癌行剖腹探查術中發現腫瘤局限于卵巢的僅占30％，大多數已擴散到子宮雙側附件，大網膜及盆腔各器官，所以卵巢癌無論在診斷和治療上確是一大難題，多年來專家們對卵巢惡性腫瘤的病理形態，臨床發生發展規律及治療方案進行了許多的探討，積累了大量的經驗到目前為止，就國內外臨床資料統計，其五年生存率僅25％～30％，主要原因是晚期發現，晚期治療?？紤]到卵巢癌早期與晚期治療預后的差異，尋找一個能夠在早期發現卵巢癌的診斷方法具有重要的臨床意義，特別是癌變前期的篩查標志物臨床意義更大，這樣就可能做到預防性早期篩查和治療，降低卵巢癌的發病率和死亡率。目前實驗室診斷卵巢癌的常用標志物為CA125，其在卵巢癌診斷中有較好臨床意義，但同時也存在一些不足,一旦發現CA125升高，腫瘤已經形成了，而且大部分都轉移了。近年來學者們還發現了其他卵巢癌標志物，其中WFDC-2（人附睪蛋白4），由柯克霍弗（Kirchhoff）等于1990年通過cDNA篩檢在附睪組織中發現，包含2個保守的乳酸蛋白基團。對該基因的氨基酸序列分析后發現，其具有大序列的奇數半胱氨酸片段，這也預示該基因可能與蛋白間的相互作用有重要聯系，基因位于人基因組染色體20q12-13.1。通過微陣列及基因表達水平證實，WFDC-2基因在卵巢癌組織中過表達，在正常組織中表達正常，因此，該基因可能為診斷卵巢癌的潛在標志物。本專利技術人在研究中發現癌癥的臨床診斷和治療都太晚了，這是導致癌癥死亡率高的關鍵原因，要改變這種狀況，必須做到癌變前期的篩查和治療，不要等到腫瘤形成后或轉移后再檢查和治療，做到預防性診治-基因水平治未病。為了驗證WFDC-2篩查早期卵巢癌的價值，本專利技術特別設計了卵巢癌患者、卵巢良性腫瘤、正常對照組，觀察WFDC-2基因mRNA表達情況，見圖2、3、4。同時發現，WFDC-2基因mRNA不僅可用于卵巢癌的早期診斷與鑒別，也可作為卵巢癌患者預后標志物，這對卵巢癌患者術后選擇積極的治療方式，實現個體化治療，最終提高卵巢癌患者生存率具有重要價值。???隨著分子生物技術日益完善，功能基因組學，癌癥基因組學等研究的深入展開，至今，我們已有可能在基因水平上做更精確的早期診斷，在癌變前期或癌細胞形成（單克隆時）就能做到早期預測診斷。WFDC-2基因的mRNA篩查技術比檢查WFDC-2蛋白要準確的多，專利技術人在研究中用雙標記技術發現mRNA和蛋白的表達有時候不同步，有的蛋白就不表達，所以，采用mRNA技術比較可靠。本專利技術人查閱相關文獻至今沒有WFDC-2基因的mRNA水平癌變前期篩查試劑盒報道，也沒有采用原位雜交技術的檢測方法。????原位雜交技術（in?situ?hybridization）是將分子生物學與細胞化學技術結合起來，以標記的核酸分子為探針，在組織細胞原位檢測特異性核酸分子的技術。其原理是使含有特異序列、經過標記的核酸單鏈（即探針），在適宜條件下與組織細胞中的互補核酸單鏈即靶核酸發生雜交，再以放射自顯影或免疫細胞化學方法對標記探針進行探測，從而在細胞原位顯示特異的DNA或RNA分子。
技術實現思路
本專利技術的目的是針對現有技術中的不足，提供一種WFDC-2基因的原位雜交檢測試劑盒的用途。本專利技術的再一的目的是，提供一種WFDC-2基因的原位雜交檢測試劑盒。本專利技術的另一的目的是，提供一種WFDC-2基因的原位雜交檢測方法。為實現上述目的，本專利技術采取的技術方案是：一種原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針和標記物，所述的雜交探針為序列表SEQ?ID?NO.1所示序列，是WFDC-2基因CDS中（38…412bp）,探針長375bp，與體內的靶片段進行反向互補雜交。WFDC-2基因為序列表SEQ?ID?NO.2所示序列，全長486bp，位于染色體20q12-q13”上。所述的雜交探針序列所示的RNA序列。所述的標記物選自放射性核素或非放射性標記物。所述的放射性核素選自3H、35S、125I或?32P中的一種。所述的非放射性標記物選自生物素、地高辛、堿性磷酸酶、辣根過氧化酶或熒光素中的一種。所述的非放射性標記物優選自地高辛。所述的試劑盒還包括增效劑，所述的增效劑是堿性磷酸酶抗體。為實現上述第二個目的，本專利技術采取的技術方案是：一種WFDC-2基因的原位雜交檢測方法，該方法包括以下步驟：a、將試劑盒中的雜交探針與底物中待測RNA接觸，形成雜交復合體；?b、檢測a步驟得到的雜交復合體。本專利技術的診斷試劑盒的組份是由雜交探針，雜交液，顯色劑，增效劑等組成。本試劑盒的核酸雜交原理是分子生物學業內人士均熟知，具體操作步驟是標本處理、預雜交、雜交、免疫組化染色、鏡下進行定量分析、結果報告，其中雜交的具體步驟包括：儀器操作：1).將待測標本放入反應槽中；2).儀器自動棄去液體，自動加消化液；?3).儀器自動棄去液體，自動后固定；4).儀器自動棄去液體，自動預雜交（42℃）；5).儀器自動棄去液體，自動清洗；6).儀器自動棄去液體，自動雜交（42℃）；7).儀器自動棄去液體，自動清洗；8).儀器自動棄去液體，自動與DIG抗體培養（室溫）；9).儀器自動棄去液體，自動清洗，顯色；10).取出封片鏡檢。本專利技術優點在于：1、本專利技術提供的試劑盒具有靈敏度高、特異性強的特點。2、本專利技術的檢測方法操作方便、簡單，能在區級以上醫院普遍使用和推廣。3、本專利技術的臨床意義是更早期跟蹤檢測卵巢癌發生動態過程，以及用于卵巢癌預防醫學的檢測和篩選工具。本專利技術的診斷試劑盒與臨床上其它檢測癌胚蛋白標志物，以及影像醫學檢查有顯著不同。本專利技術是用于癌變前期的mRNA水平上檢測WFDC-2異常表達，在影像醫學檢查及其它檢查未發現占位性卵巢癌病灶之前，癌癥生化指標未產生異常之前，亦未形成腫塊之前，能及早做到以上基因表達異常的信息采集，給臨床卵巢癌病患一個真正的預后早期診斷。這樣才有可能實施卵巢癌的早期診斷、早期預防、早期治療，有可能從源頭上徹底根治卵巢癌惡疾。附圖說明圖1是核酸原位雜交技術流程圖。圖2是本專利技術實施例中卵巢癌病人WFDC-2基因表達圖片。圖3是本專利技術實施例中卵巢良性腫本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針和標記物，其特征在于，所述的雜交探針為序列表SEQ？ID？NO.1所示序列。

【技術特征摘要】
1.一種原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針和標記物，其特征在于，所述的雜交探針為序列表SEQ?ID?NO.1所示序列。
2.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的標記物選自放射性物質、化學發光或顯色物質、生物素、金屬鱟、熒光素、酶及納米材料。
3.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括雜交液。
4.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括增效劑。
5.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括顯色劑。
6.一種WFDC-2基因原位雜交檢測方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：
（1）在權...

【專利技術屬性】
技術研發人員：張玉麗，裘建英，張云福，裘霖，
申請(專利權)人：芮屈生物技術上海有限公司，
類型：發明
國別省市：