測量干血斑中無細胞病毒顆粒的方法技術

描述了測量干血斑中游離核酸和/或病毒顆粒的方法。所述方法可包括以下步驟：再水化干血樣、任選地將存在于所述再水化的干血樣中的細胞固定、將游離病毒顆粒從所述再水化的干血樣中洗脫、使用過濾器將所述游離病毒從可能存在于所述再水化的干血樣中的任何細胞殘渣上分離以及通過病毒顆粒定量技術測量游離病毒顆粒。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】專利
本專利技術涉及測量血液中病毒載量的領域，并且更具體地講，涉及測量干血斑中無細胞病毒顆粒的方法。專利技術背景2013年，世界衛生組織（WHO）修訂了現行的HIV治療和預防準則并強調了HIV病毒載量（VL）測試在對HIV陽性患者的管理中的重要性。WHO強烈推薦使用HIV病毒載量測試替代臨床表現和CD4細胞計數以監測HIV抗逆轉錄病毒療法（ART），并且將對于治療效果的HIV血漿VL水平的截斷值從5000份拷貝/mL降至1000份拷貝/mL。換句話講，如果接受ART治療的HIV患者血漿中的病毒滴度大于1000份拷貝/mL，則將看作是藥物治療失敗。對治療失敗的應對（如依從性咨詢、藥物耐藥性測試和二線治療方案）是耗時且昂貴的，而應當僅在有必要時使用。在感染后，HIV病毒不僅在被感染的細胞內開始自我復制，還將其cDNA整合至宿主染色體中作為潛伏的HIV前病毒DNA（Greene,W.C.與Peterlin,B.M.,2002,ChartingHIV’sremarkablevoyagethroughthecell,NatMed.8(7):673-80;Blankson,J.N.,D.Persaud,R.F.Siliciano,2002,TheChallengeofViralReservoirsinHIV-1Infection,Annu.Rev.Med.53:557-593）。通常使用血漿作為標本類型測量HIV病毒載量。然而，在資源有限的環境中，如非洲，血漿樣品可能不易獲得、保存、轉移和測試（世界衛生組織2013，關于使用抗逆轉錄病毒藥物治療和預防HIV感染的綜合準則：對公共衛生措施的建議。世界衛生組織，日內瓦）。已經就干血斑（DBS）作為在資源有限的環境中HIV病毒載量測試的解決方案進行了評價，但取得了有限的成功（SmitPW等人，2014,SystematicreviewoftheuseofdriedbloodspotsformonitoringHIVviralloadandforearlyinfantdiagnosis,PLoSONE.9(3):e86461;Bertagnolio,S.,N.T.Parkin,M.Jordan,J.Brooks,J.G.Garcia-Lerma,2010;DriedbloodspotsforHIV-1DrugResistanceandViralLoadTesting:AReviewofCurrentKnowledgeandWHOEffortsforGlobalHIVDrugResistanceSurveillance,AIDSRev.12:195-208;Johannessen,A,2010;DriedbloodspotsinHIVmonitoring:applicationsinresource-limitedsettings,Bioanalysis.2(11):1893-1908）。RocheMolecularDiagnostics（RMD）于2009年開發了一款僅研究使用（RUO）的產品，其使用實時PCRCOBAS?AmpliPrep/COBAS?TaqMan?(CAP/CTM)HIV-1測試v2.0和干燥液斑法（DFSP）以測量DBS中的HIV病毒載量。遺憾的是，當測試成對的血漿和DBS樣品時，相比血漿金標準，DFSP測試得到了更高的病毒載量滴度。這一過高估計在具有血漿病毒載量小于5,000份拷貝/mL的樣品中尤為明顯，據推測是由于檢測到了與細胞結合的HIVDNA和RNA。根據CAP/CTMHIV-1DFSP方法，首先將HIVDBS與離液劑-樣本預提取(SPEX)緩沖液一起溫育，而將總核酸，包括血液流體中的HIV病毒RNA，加上其它與細胞結合的HIVDNA和RNA（如HIV前病毒DNA），從DBS中提取出并洗脫到SPEX緩沖液中。然后，將提取出的緩沖液置于CAP/CTM儀器上進行核酸純化，然后是HIV靶標擴增和檢測。現行的用于HIVDBSVL測量的核酸提取方法充分裂解所有細胞并使所有蛋白質復合物變性，使得總核酸（包括血液流體中的無細胞HIV病毒顆粒和與細胞結合的HIVRNA和DNA）從DBS中被完全提取出。對DBS中HIVVL的過度量化不只是Roche的DBS測定的問題，在其它市售測定（如Abbott的HIVDBS測定）中也有觀測到。在HIV科學和醫學界，已經推測，存在于DBS中被HIV感染的細胞內的HIVDNA會造成對病毒載量的過度量化，但這一過度量化現象的確切機制尚不清楚或尚未得到證實（MédecinsSansFrontièresAccessCampaign,2013）。可以通過對RNA比對DNA更有特異性的擴增方法（例如，BioMerieuxNucliSENS?所用的NASBA方法）來改善但非消除DBS中的過高估計。仍然存在對于解決樣品中HIVVL過度量化挑戰的替代方法的需求。專利技術概述一種對于DBS中過高估計的解決方法可以是：類似于血漿樣品，從樣品中移除與細胞結合的RNA和DNA，僅留下待檢測的無細胞病毒。這可以防止將患者錯誤歸類為治療失敗而造成的高昂代價。本公開中描述了此類方法及相關益處。在一個實施方案中，提供了測量干血斑中無細胞核酸和/或病毒顆粒的方法。該方法可包括以下步驟：將干血樣再水化，通過向干血樣施加緩沖溶液以產生再水化的干血樣；任選地，使用固定劑將存在于再水化的干血樣中的細胞固定以將與細胞結合的RNA和/或DNA包含在細胞內；使用洗脫劑將無細胞核酸和/或病毒顆粒從再水化的干血樣中洗脫，所述洗脫劑優先地洗脫無細胞病毒顆粒而不破壞與細胞結合的RNA和/或DNA；使用過濾器將無細胞核酸和/或病毒顆粒從可能存在于再水化的干血樣中的任何細胞碎片上分離；以及通過病毒顆粒定量技術測量無細胞核酸和/或病毒顆粒，所述病毒顆粒定量技術選自：序列特異性核酸定量、酶聯免疫吸附測定（ELISA）、聚合酶鏈式反應（PCR）、等溫核酸擴增、核酸雜交、原位雜交和電子顯微鏡。在一些實施方案中，DBS中待測量的病毒顆粒可以是人類免疫缺陷病毒（HIV）、人類嗜T淋巴細胞病毒-1或-2（HTLV-1或-2）、丙型肝炎病毒（HCV）、乙型肝炎病毒（HBV）、巨細胞病毒（CMV）（例如，人類CMV）和Epstein-Barr病毒（EBV）中的一種或多種。緩沖溶液的實施方案可以包括固定劑和洗脫劑。固定劑的一個實施方案可以是甲醇，且洗脫劑的一個實施方案可以是磷酸鹽緩沖鹽水或其它合適的緩沖液。在本方法的一些實施方案中，分離步驟可包括離心柱過濾、真空過濾或離心。實施本文檔來自技高網...

【技術保護點】
測量干血斑中無細胞病毒顆粒的方法，包括：再水化干血樣，其通過向干血樣施加緩沖溶液以產生再水化的干血樣；任選地，使用固定劑將存在于所述再水化的干血樣中的細胞固定以用細胞包含與細胞結合的RNA和/或DNA；使用洗脫劑將無細胞病毒顆粒從所述再水化的干血樣中洗脫，所述洗脫劑優先地洗脫無細胞病毒顆粒而不破壞與細胞結合的RNA和/或DNA；使用過濾器將所述無細胞病毒從可能存在于所述再水化的干血樣中的任何細胞碎片上分離；以及通過病毒顆粒定量技術測量無細胞病毒顆粒。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2013.10.22 US 61/894332;2014.02.28 US 61/945974;201.測量干血斑中無細胞病毒顆粒的方法，包括：
再水化干血樣，其通過向干血樣施加緩沖溶液以產生再水化的干血樣；
任選地，使用固定劑將存在于所述再水化的干血樣中的細胞固定以用細胞包含與細胞
結合的RNA和/或DNA；
使用洗脫劑將無細胞病毒顆粒從所述再水化的干血樣中洗脫，所述洗脫劑優先地洗脫
無細胞病毒顆粒而不破壞與細胞結合的RNA和/或DNA；
使用過濾器將所述無細胞病毒從可能存在于所述再水化的干血樣中的任何細胞碎片
上分離；以及
通過病毒顆粒定量技術測量無細胞病毒顆粒。
2.根據權利要求1的方法，其中所述病毒顆粒定量技術選自序列特異性核酸定量、
ELISA、PCR、等溫核酸擴增、核酸雜交、原位雜交和電子顯微鏡。
3.根據權利要求1的方法，其中所述病毒選自HIV、HTLV、HCV、HBV、CMV和EBV。
4.根據權利要求1的方法，其中所述...

【專利技術屬性】
技術研發人員：P鮑姆，M克拉斯克，X吳，
申請(專利權)人：豪夫邁·羅氏有限公司，
類型：發明
國別省市：瑞士;CH