一種測(cè)定待測(cè)基因組區(qū)域表達(dá)水平的方法及系統(tǒng)技術(shù)方案

本發(fā)明專利技術(shù)提供了一種檢測(cè)基因組區(qū)域表達(dá)水平(RPKM)的方法和系統(tǒng)，采用本發(fā)明專利技術(shù)，一方面，可以檢測(cè)出整個(gè)基因的表達(dá)水平及其所有外顯子各自的表達(dá)水平；另一個(gè)方面可以檢測(cè)出同一個(gè)基因不同的同源異構(gòu)體的表達(dá)水平及其所有外顯子各自的表達(dá)水平；最后還可以檢測(cè)出基因組任意指定區(qū)間的表達(dá)水平。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
一種測(cè)定待測(cè)基因組區(qū)域表達(dá)水平的方法及系統(tǒng)
本專利技術(shù)涉及生物技術(shù)和生物信息學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種測(cè)定基因組區(qū)域表達(dá)水平的方法及系統(tǒng)。
技術(shù)介紹
生命遺傳信息的表達(dá)調(diào)控既是生物學(xué)研究的重點(diǎn)領(lǐng)域，也是揭示生物學(xué)各種生命現(xiàn)象的重要手段，尤其是隨著21世紀(jì)大量物種基因組序列的測(cè)定以及大量測(cè)序技術(shù)推陳出新，使得基因表達(dá)定量方面的研究突飛猛進(jìn)。測(cè)序技術(shù)也從傳統(tǒng)Sanger測(cè)序技術(shù)，迅速發(fā)展為多種第二代高通量測(cè)序技術(shù)，如羅氏454、IlluminaHiSeq和AB公司的SOLiD，以及第三代的單分子實(shí)時(shí)DNA測(cè)序技術(shù)。其中，Sanger測(cè)序技術(shù)和羅氏454測(cè)序技術(shù)的測(cè)序讀長(zhǎng)在700-1000bp，Illumina測(cè)序技術(shù)的測(cè)序讀長(zhǎng)平均100bp左右，而單分子實(shí)時(shí)DNA測(cè)序技術(shù)的讀長(zhǎng)達(dá)到了2500-3000bp。第二代測(cè)序技術(shù)也被稱為新一代測(cè)序技術(shù)(NGS,NextGenerationSequencing)，目前主要是Illumina公司出的HiSeq為主，它通過(guò)從物種中提取出的RNA轉(zhuǎn)錄本中隨機(jī)進(jìn)行的短片段測(cè)序(通常平均讀長(zhǎng)50bp、75bp、100bp)獲得所測(cè)樣本的整體表達(dá)譜。轉(zhuǎn)錄本是通過(guò)以連續(xù)性基因組為模板進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，然后剪切去除內(nèi)含子，拼接剩余的外顯子而形成的。測(cè)序過(guò)程中，如果一個(gè)轉(zhuǎn)錄本的豐度高，則測(cè)序后定位基因組區(qū)域的測(cè)序讀段也就多，可以通過(guò)對(duì)定位到基因上的外顯子區(qū)的測(cè)序讀段數(shù)來(lái)估計(jì)基因表達(dá)水平。測(cè)序讀段數(shù)除了與基因真實(shí)表達(dá)水平成正比，還與基因長(zhǎng)度成正比，同時(shí)也與測(cè)序深度即測(cè)序?qū)嶒?yàn)中得到的總讀段數(shù)正相關(guān)。為了保持對(duì)不同基因和不同實(shí)驗(yàn)間估計(jì)的基因表達(dá)值的可比性，Mortazavi等人提出了RPKM(ReadsPerKilo-baseperMillionreads)的概念，并成為RNA-seq應(yīng)用早期估計(jì)基因表達(dá)水平和外顯子表達(dá)水平的主要方法。RPKM是每百萬(wàn)讀段中來(lái)自于某基因每千堿基長(zhǎng)度的讀段數(shù)，考慮了測(cè)序深度對(duì)讀段計(jì)數(shù)的影響。新一代測(cè)序技術(shù)的廣泛普及，使得RNA測(cè)序(RNA-seq)已成為基因表達(dá)和轉(zhuǎn)錄組分析的重要手段。在NGS測(cè)序技術(shù)出現(xiàn)之前，不同基因表達(dá)水平測(cè)量的主要手段是基因芯片，利用在基因芯片上高密度集成特點(diǎn)的寡核苷酸，可以對(duì)不同組織或者不同發(fā)育階段的特定基因表達(dá)差異和模式進(jìn)行分析。但是與基因芯片數(shù)據(jù)相比，RNA-seq得到的是全基因組轉(zhuǎn)錄水平的數(shù)字化信號(hào)，具有高靈敏度、高分辨率、無(wú)飽和區(qū)等優(yōu)勢(shì)。隨著新一代測(cè)序技術(shù)的不斷進(jìn)步，產(chǎn)生的RNA-seq數(shù)據(jù)通量高、周期短和成本低，越來(lái)越多的人選擇轉(zhuǎn)錄組測(cè)序作為科學(xué)研究的首選。RPKM在評(píng)估基因表達(dá)水平上的作用越來(lái)越顯著，人們通過(guò)基因包含的外顯子信息，和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)在基因組上的定位信息，來(lái)計(jì)算出RPKM值。FPKM(fragmentsperkilobaseofexonpermillionfragmentsmapped)也可以用來(lái)表示基因表達(dá)水平。FPKM與RPKM計(jì)算方法基本一致。不同點(diǎn)就是FPKM計(jì)算的是片段(fragments)，而RPKM計(jì)算的是測(cè)序讀段(reads)。目前cufflinks軟件包中的cufflinks模塊和cuffdiff模塊及eXpress軟件可以計(jì)算相關(guān)基因表達(dá)水平，具體計(jì)算過(guò)程為，首先統(tǒng)計(jì)出映射定位到基因組上的所有測(cè)序讀段數(shù)目，然后統(tǒng)計(jì)出定位到各個(gè)基因外顯子區(qū)間上的所有測(cè)序讀段的數(shù)目，再計(jì)算出基因包含的外顯子的長(zhǎng)度，最后計(jì)算出基因的FPKM值。但是，上述軟件存在以下問(wèn)題：(1)目前大部分計(jì)算RPKM的程序，僅支持TopHat、Bowtie、bwa等少數(shù)常用的序列比對(duì)定位程序，不能支持所有的Illumina/Solexa測(cè)序平臺(tái)的讀段定位程序；(2)在選擇注釋文件的時(shí)候，通常僅支持已知的基因注釋文件，不能支持多種文件格式；(3)在計(jì)算基因表達(dá)水平的時(shí)候，通常計(jì)算的是片段的表達(dá)水平值，而不是整個(gè)基因的表達(dá)水平值；(4)在計(jì)算表達(dá)水平的時(shí)候，沒有計(jì)算出單個(gè)外顯子的表達(dá)水平；(5)在計(jì)算表達(dá)水平的時(shí)候，不能夠計(jì)算出基因組任意指定區(qū)間的表達(dá)水平；(6)在計(jì)算表達(dá)水平的時(shí)候，通常僅支持計(jì)算一個(gè)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，不能夠同時(shí)支持多個(gè)轉(zhuǎn)錄測(cè)序結(jié)果的基因表達(dá)水平的計(jì)算。因此，本領(lǐng)域期待一種能夠檢測(cè)基因表達(dá)水平和基因組任意指定區(qū)間表達(dá)水平的方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是提供一種檢測(cè)基因組區(qū)域表達(dá)水平(RPKM)的方法和系統(tǒng)。本專利技術(shù)的第一方面提供了一種測(cè)定待測(cè)基因組區(qū)域表達(dá)水平的方法，包括以下步驟：(1)對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行測(cè)序，獲得包含待測(cè)基因組區(qū)域轉(zhuǎn)錄本的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)；(2)將獲得的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)與同一物種的基因組序列進(jìn)行比對(duì)；(3)對(duì)定位到基因組的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序讀段進(jìn)行篩選，所述篩選包括去除測(cè)序質(zhì)量≤99.9%的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序讀段；(4)將篩選后的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序讀段，按照其定位到基因組上的起始位置進(jìn)行排序，并對(duì)排序結(jié)果建立索引；(5)根據(jù)待測(cè)基因組區(qū)域的位置信息，構(gòu)建出計(jì)算RPKM的基因注釋文件；(6)計(jì)算能夠映射到基因組上的所有測(cè)序讀段的總數(shù)M；(7)根據(jù)上述步驟(5)構(gòu)建的基因注釋文件計(jì)算出定位至待測(cè)DNA區(qū)間上所有測(cè)序讀段的總數(shù)R；(8)根據(jù)上述步驟(5)構(gòu)建的基因注釋文件，計(jì)算出待測(cè)DNA區(qū)間所有被測(cè)序讀段定位的序列長(zhǎng)度L；和(9)根據(jù)上述步驟(6)-(8)的計(jì)算結(jié)果，將步驟(7)得到的R除以步驟(6)得到的M與步驟(8)得到的L乘以109，得待測(cè)基因組區(qū)域的RPKM值，即為待測(cè)基因組區(qū)域的表達(dá)水平，計(jì)算公式如下，在另一優(yōu)選例中，所述待測(cè)基因組區(qū)域包含N個(gè)同源異構(gòu)體，且N≥2。如N可以為2、3、4、5、6、7、8、9、10或大于10。在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括結(jié)果驗(yàn)證步驟：提取待測(cè)樣品的總RNA，經(jīng)過(guò)反轉(zhuǎn)錄得到其cDNA，以cDNA作為模板進(jìn)行PCR檢測(cè)，驗(yàn)證待測(cè)基因組區(qū)域的表達(dá)水平。在另一優(yōu)選例中，所述步驟(5)中所述注釋文件整合有已有的基因注釋信息、新預(yù)測(cè)的基因注釋信息和/或基因組任意指定區(qū)間的注釋信息。在另一優(yōu)選例中，所述待測(cè)基因組區(qū)域表達(dá)水平，可以為單個(gè)基因的表達(dá)水平、同一個(gè)基因不同的同源異構(gòu)體的表達(dá)水平、所有外顯子的表達(dá)水平、單個(gè)外顯子的表達(dá)水平以及基因組任意指定區(qū)間的表達(dá)水平。在另一優(yōu)選例中，當(dāng)所述待測(cè)基因組區(qū)域中包含兩個(gè)以上的同源異構(gòu)體基因序列時(shí)，在測(cè)定過(guò)程中還包括步驟：將各同源異構(gòu)體的所有外顯子進(jìn)行整合，對(duì)于重復(fù)的序列區(qū)間，僅保留單一序列，從而將同一待測(cè)基因組區(qū)域中的不同同源異構(gòu)體的外顯子整合成單一序列，將該單一序列的長(zhǎng)度作為計(jì)算該基因組區(qū)域表達(dá)水平時(shí)的序列長(zhǎng)度L。在另一優(yōu)選例中，所述步驟(1)中，所述轉(zhuǎn)錄組序列數(shù)據(jù)由羅氏454測(cè)序技術(shù)、Illumina測(cè)序技術(shù)、AB公司的SOLiD技術(shù)、或者第三代的單分子實(shí)時(shí)DNA測(cè)序技術(shù)獲得。在另一優(yōu)選例中，所述步驟(2)中，序列比對(duì)程序?yàn)閠ophat2，以程序默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行比對(duì)。在另一優(yōu)選例中，所述步驟(2)中，比對(duì)結(jié)果存儲(chǔ)為SAM(SequenceAlignment/Map)格式或其二進(jìn)制版本BAM格式的定位文件。在另一優(yōu)選例中，所述步驟(4)中，所述排序方法為：a.按照每條測(cè)序讀段定位到基因組的起始位置進(jìn)行排序；b.如果測(cè)序讀段在基因組位置中的起始位置相同，按照其定位到基因組的先后本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種測(cè)定待測(cè)基因組區(qū)域表達(dá)水平的方法，其特征在于，包括以下步驟：(1)對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行測(cè)序，獲得包含待測(cè)基因組區(qū)域轉(zhuǎn)錄本的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)；(2)將獲得的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)與同一物種的基因組序列進(jìn)行比對(duì)；(3)對(duì)定位到基因組的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序讀段進(jìn)行篩選，所述篩選包括去除測(cè)序質(zhì)量≤99.9%的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序讀段；(4)將篩選后的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序讀段，按照其定位到基因組上的起始位置進(jìn)行排序，并對(duì)排序結(jié)果建立索引；(5)根據(jù)待測(cè)基因組區(qū)域的位置信息，構(gòu)建出計(jì)算RPKM的基因注釋文件；(6)計(jì)算能夠映射到基因組上的所有測(cè)序讀段的總數(shù)M；(7)根據(jù)上述步驟(5)構(gòu)建的基因注釋文件計(jì)算出定位至待測(cè)DNA區(qū)間上所有測(cè)序讀段的總數(shù)R；(8)根據(jù)上述步驟(5)構(gòu)建的基因注釋文件，計(jì)算出待測(cè)DNA區(qū)間所有被測(cè)序讀段定位的序列長(zhǎng)度L；和(9)根據(jù)上述步驟(6)?(8)的計(jì)算結(jié)果，將步驟(7)得到的R除以步驟(6)得到的M與步驟(8)得到的L乘以109，得待測(cè)基因組區(qū)域的RPKM值，即為待測(cè)基因組區(qū)域的表達(dá)水平，計(jì)算公式如下，RPKM=RM×L×109.]]>

【技術(shù)特征摘要】
1.一種測(cè)定待測(cè)基因組區(qū)域表達(dá)水平的方法，其特征在于，包括以下步驟：(1)對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行測(cè)序，獲得包含待測(cè)基因組區(qū)域轉(zhuǎn)錄本的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)；(2)將獲得的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)與同一物種的基因組序列進(jìn)行比對(duì)；(3)對(duì)定位到基因組的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序讀段進(jìn)行篩選，所述篩選包括去除測(cè)序質(zhì)量≤99.9％的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序讀段；(4)將篩選后的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序讀段，按照其定位到基因組上的起始位置進(jìn)行排序，并對(duì)排序結(jié)果建立索引；(5)根據(jù)待測(cè)基因組區(qū)域的位置信息，構(gòu)建出計(jì)算RPKM的基因注釋文件；(6)計(jì)算能夠映射到基因組上的所有測(cè)序讀段的總數(shù)M；(7)根據(jù)上述步驟(5)構(gòu)建的基因注釋文件計(jì)算出定位至待測(cè)DNA區(qū)間上所有測(cè)序讀段的總數(shù)R；(8)根據(jù)上述步驟(5)構(gòu)建的基因注釋文件，計(jì)算出待測(cè)DNA區(qū)間所有被測(cè)序讀段定位的序列長(zhǎng)度L；和(9)根據(jù)上述步驟(6)-(8)的計(jì)算結(jié)果，將步驟(7)得到的R除以步驟(6)得到的M與步驟(8)得到的L乘以109，得待測(cè)基因組區(qū)域的RPKM值，即為待測(cè)基因組區(qū)域的表達(dá)水平，計(jì)算公式如下，其中，所述待測(cè)基因組區(qū)域包含N個(gè)同源異構(gòu)體，且N≥2；并且，在測(cè)定過(guò)程中還包括步驟：將各同源異構(gòu)體的所有外顯子進(jìn)行整合，對(duì)于重復(fù)的序列區(qū)間，僅保留單一序列，從而將同一待測(cè)基因組區(qū)域中的不同同源異構(gòu)體的外顯子整合成單一序列，將該單一序列的長(zhǎng)度作為計(jì)算該基因組區(qū)域表達(dá)水平時(shí)的序列長(zhǎng)度L。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，N為2、3、4、5、6、7、8、9、10或大于10。3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法還包括結(jié)果驗(yàn)證步驟，所述結(jié)果驗(yàn)證步驟包括：提取待測(cè)樣品的總RNA，經(jīng)過(guò)反轉(zhuǎn)錄得到其cDNA，以cDNA作為模板進(jìn)行PCR檢測(cè)，驗(yàn)證待測(cè)基因組區(qū)域的表達(dá)水平。4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述待測(cè)基因組區(qū)域表達(dá)水平，為單個(gè)基因的表達(dá)水平、同一個(gè)基因不同的同源異構(gòu)體的表達(dá)水平、所有外顯子的表達(dá)水平、單個(gè)外顯子的表達(dá)水平以及基因組任意指定區(qū)間的表達(dá)水平，其中所述基因組任意指定區(qū)間包含染色體名稱、基因組起始位置和基因組終止位置。5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中，所述轉(zhuǎn)錄組序列數(shù)據(jù)由羅氏454測(cè)序技術(shù)...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：楊力，朱閃閃，薛尉，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：上海;31