棉花BZR1基因鑒定及應用制造技術

本發明專利技術涉及一個棉纖維優勢表達的基因GhBZR1的克隆與功能鑒定。GhBZR1基因全長1410bp，編碼一個含有313氨基酸的蛋白質。該基因的mRNA在伸長發育時期的棉纖維細胞中大量積累，表明該基因為纖維優勢表達基因。GhBZR1蛋白定位于細胞質和細胞核中，BL誘導后，該蛋白在細胞核中積累增加。GhBZR1能夠與GhBIN2發生相互作用，并被后者磷酸化，從而促進該蛋白與14-3-3蛋白之間的相互作用。在擬南芥BR突變體bri1中過量表達GhBZR1，能夠恢復其矮小的表型。利用RNAi干擾技術抑制棉花中的GhBZR1表達，轉基因棉花植株胚珠及纖維發育受到明顯影響，推測GhBZR1可能通過影響BR信號來調節棉纖維發育及纖維品質性狀。

【技術實現步驟摘要】
棉花BZR1基因鑒定及應用
本專利技術涉及一個棉纖維優勢表達的基因GhBZRl的克隆與功能鑒定。
技術介紹
棉花是世界上最重要的天然纖維作物，我國是世界上最大的產棉國和棉花消費國，棉花生產在我國國民經濟中占有十分重要的地位。棉纖維是棉花生產的主要產品，其產量和品質直接決定了棉花生產的產值和效益，因此提高棉纖維的產量和品質一直以來都是棉花育種的主要目標。然而由于棉花纖維的產量和品質之間存在負相關，嚴重阻礙棉花纖維產量和品質的同步改良。傳統育種方法難以打破產量和品質的負相關，必須尋找新的途徑以達到兩者同步改良。棉花纖維細胞是由胚珠外表皮分化而成的不分枝單細胞毛狀突起，其發育由四個重疊但是可區分的發育階段組成，分別是纖維起始、伸長、次生壁合成及脫水成熟。棉花纖維在這四個階段中的發育情況決定了其產量和品質，纖維細胞的起始決定了最終纖維的數量，纖維細胞的伸長決定了成熟纖維的長度，次生壁合成決定了纖維的強度。因此，克隆棉花纖維發育相關基因并研究基因產物之間的關系，解析棉花纖維發育的分子機制，不僅具有重要的理論意義，而且對棉花纖維產量和品質改良具有重要的應用價值。棉花纖維發育過程受激素水平的調控。油菜素內醋、生長素、赤霉素等激素都在纖維細胞起始和發育過程中起到至關重要的作用。研究證明，外施一定濃度的上述激素能夠促進棉纖維細胞發育。雖然目前已經在棉花中分離鑒定了一些與激素信號相關的基因，但是這些基因在棉花激素信號傳遞途徑中的功能及對棉花纖維發育影響的作用機制尚不清楚，一些關鍵的調控蛋白也有待克隆鑒定并闡明其功能。因此，研究棉花中激素信號的傳遞途徑，特別是對棉花纖維發育的影響，分離鑒定相關重要調控因子，對于棉花纖維品質改良，具有重要意義。 油菜素內酯(BR)作為一種重要的植物激素，在植物的生長發育中發揮著重要的作用。BR信號在植物體內的轉導是一個復雜的過程。在擬南芥中，BR信號由細胞膜受體蛋白 BRIl 接受(She et al., 2011 ；Hothorn et al.，2011)。當缺乏 BR 時，負調控因子 BKIl結合BRIl，抑制其功能(Wang et al., 2006 Jaillais et al., 2011) ;BIN2激酶磷酸化植物特異性的轉錄因子BESl和BZRl (Yin et al.，2005 ；He et al.，2005)，抑制其DNA結合活性。14-3-3蛋白與磷酸化的BES1/BZR1相互作用，使其滯留在細胞質中。當有BR信號時，BR分子結合BRIl的胞外域，促進BRIl與BAKl相互作用，激活受體激酶活性，BRIl激酶促進BKII磷酸化，同時BRII與BKIl分離。14_3_3蛋白可以通過兩個磷酸化位點的基序與磷酸化的BKII相互作用。細胞質中BKIl與14-3-3結合，激活的BRIl和BAKl間接導致BIN2活性的抑制或BSUl的激活或者兩種情況同時存在(Kim et al.,2011 ；Kim et al., 2009 ；Tang et al., 2008 ；Li et al.，2002)。同時，PP2A 使得 BES1/BZR1 去磷酸化，促使 BESl/BZRl在核中大量積累，BZRl結合BR合成基因的啟動子，抑制BR合成基因的表達，從而降低BR的水平。非磷酸化狀態的BESl也在核中積累，在核中激活BR誘導基因的表達(Tanget al., 2011)。在BR通路中，BZRl是關鍵的轉錄因子，屬于植物特異的BZR蛋白家族成員，在擬南芥中有5個同源蛋白，分別是BZR2/BES1，BZR3/BEH1, BEH2, BEH3, BEH4。水稻中克隆出 4 個 BZRl 蛋白，OsBZRl - 4 (0s07g39220, 0s01gl0610, 0s06g35900 和 0s02gl3900)，OsBZRl (0s07g39220)與擬南芥 BZRl 有 53.39% 同源性，BZR2/BES1 有 53.25% 同源性。擬南芥BZRl和BZR2有88 %的氨基酸同源性，蛋白中有25個可能的磷酸化位點，在應答BR信號時功能上有部分冗余(Wang et al.，2002 ；Yin et al.，2002:Li et al.，2007)。BZRl和BESl是BR通路中BR信號轉導的關鍵轉錄因子，通過直接結合下游基因的啟動子或與其它蛋白相互作用調控BR應答基因的表達。BESl受BR激活后，使其能結合存在于大量的BR應答基因啟動子的E-Boxes (CANNTG) (Yin et al.，2005)。轉錄因子AtMYB30在BR信號通路中正調控BR應答基因，體內和體外實驗已經證明BESI能同AtMYB30相互作用，促進下游靶基因的表達(Li et al.，2009)。BESl也能同參與核糖核酸聚合酶II (RNAPII)后招募和翻譯伸長過程的IWSl蛋白發生相互作用(Li et al.，2010)。功能缺失iwsl突變體下胚軸對BR不敏感，并且IWSl的缺失導致功能獲得性突變體besl-D表型受抑制，推測IWSl需要BESl調控的轉錄過程參與染色體修復(Li et al.，2010)。BZRl與BESl有88%的同源性(Wang et al.，2002)。BZRl 能夠結合 BR 元件(BRRE, CGTG (T/C) G)，BZRl 的 N-端負調控參與BR生物合成基因表達，如CPD, DWF4, R0T3和BR6ox (He et al.，2005)。BESl對BR生物合成基因的表達反饋調節功能與BZRl相似(Vert and Chory, 2006 ；Yin et al.，2005)。Sun等報道了 953個BR調控的BZRl靶基因，參與BR促進的細胞伸長，BR和其他激素的交叉通路，光信號通路等(Sun et al.，2010)。轉錄因子BZRl和BZR2 (BESl)在BR信號通路中起關鍵作用，影響植物的生長發育過程。在水稻中，利用RNAi干擾技術，抑制OsBZRl的表達，導致植物出現矮化，葉片直立，對BR敏感度降低等表型，而 過量表達0sBZRlP206L，葉片彎曲度增加(Bai et al.，2007)。從乙烷基甲磺酸酯(EMS)誘變的突變體中分離出來的besl-D和bzrl_lD突變體，是BESl/BZRl在231-250氨基酸有PEST基序突變得到，這個基序在調控BESl和BZRl的穩定性有重要的作用(Yin et al.，2002, 2005)。besl-D 和 bzrl-lD 突變體能夠恢復 bril 和 bin2_lD的表型。此外bzrl-lD對BR合成抑制劑BRZ不敏感，推測BESl和BZRl是BR信號的正調控因子(Yin et al., 2002 ；ffang et al.，2002)。因此，研究探討棉纖維優勢表達的BZRl轉錄因子在纖維品質性狀形成中的調控作用，將能夠使我們更好地了解棉花BZRl轉錄因子如何參與棉纖維內源BR激素的調控及其在棉纖維發育和品質性狀形成過程中的功能，進而應用于棉纖維品質的遺傳改良。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一個新的棉纖維優勢表達的BZRl基因(GhBZRl)，分析揭示該基因的生物學功能，探索其對纖維發育調本文檔來自技高網...

【技術保護點】
棉花GhBZR1基因的cDNA序列如下：基因編碼區為第1位至第942位堿基。

【技術特征摘要】
1.棉花GhBZRl基因的cDNA序列如下:ATGACGTCAG ATGGGGCGAC GTCGACGCCG GCACCAGTGC CAAGGAGGAA ACCTTCTTGG AGGGAGAGAG 70AGAACAACAG GAGGAGGGAG AGGAGGAGAA GAGCTATCGC TGCTAAGATA TATACTGGGC TGAGAGCTCA 140AGGAAATTAT AATCTGCCCA AGCACTGTGA TAACAACGAG GTCCTCAAAG CTCTTTGTGC CGAGGCTGGT 210TGGGTTGTTG AAGATGATGG CACCACTTAT CGAAAGGGAT GTAAGCCACC TCCGATTGAT ATAGCAGGCA 280GTTCAGCTAA AATTACCCCA TATTCTTCCC AAAATCCTAG TCCCTTATCT TCTGCATTTC CAAGTCCAAT 350TCCTTCATGT CAAGTCAGTC CTTCCTCCTC TTCCTTCCCC AGTCCCACTA GGACTGATGC AAATAATCCA 420TCTAGTCTCC TTCCGTTCCT CAGAAGCGCC ATTCCTTCGT CTCTGCCTCC TCTCAGAATC TCTMTAGTG 490CCCCCGTGAC ACCACCACTT TCTTCTCCAA CCTCCAGAAA TCCTAAGCCC ATTCCCAACT GGGAGGCCCT 560TGCCAAAGAG TCCATGGCCT CTTTTAACTA CCCTTTTTAT GCTGTCTCTG CACCAGCTAG TCCMCCCAT 630CGTCATTTCC ATGCCCCTGC TACTATACCC GAATGTGATG AATCAGACAC GTCCACAGTT GAATCTGGTC 700AATGGATAAG CTTTCAAAAG TTTGCACCTT CTACATCTCA AGTGCCGACT TCGCCAACAT TCAATCTTGT 770AAAACCTTTG GCTCCACAAA GTTTGCCCAC CGGTTTTATT GGAGAGCAAG GGCGAGTTTC AGAGTTTCAG 840TTTGAGAACG GACAGGTAAA GCCGTGGGAG GGTGAAAGGA TTCACGAGGT AGGATTGGAT GATCTGGAGC 910TCACACTCGG AAGTGGGAAA GCTCGATGTT GAMAGAGGC TAACAGTCGG AGTGATTGTT GTGAAAGCGT 980GTTACAACAG AGAAAGAGC CAGTTTGCCC TTCCTGATTC TCGGTTCTCA CAGTCAGATA CTAAAGAGCG 1050TTGATIGTI'G TTCATCCAC TCAGTGAAAG CTGGAAATCA TAGAACAAAG GTGGCAGAAG AGTTMCAGT 1120TTCATCCGCA TGTTTCGTT TCTATTTCAG TCGGTTGATA CTCGCATTCC CTGGTTGAAT CCTTAGGGAA 1190TTGGGGTTGT TTTATAAGC ATTACTTGTA GATACTGTGG TATATTTCTG GTTGTGATAG AGTTGCTTAA 1260ATCTTTTCCT TTAGGTTTT GTAGTCTTGG GTAAAACCGC AGAGAATGAT ATTGTTGTAC TGGTTTGTAC 1330TGT...

【專利技術屬性】
技術研發人員：李學寶，周穎，李曉潔，李沫，張則婷，
申請(專利權)人：華中師范大學，
類型：發明
國別省市：湖北;42