一種提高棉花轉基因效率的方法技術

本發明專利技術提供了一種提高棉花轉基因效率的方法，所述方法含有以下步驟：a.采用農桿菌介導法將含有目的基因的植物表達載體侵染棉花無菌苗莖尖，將侵染后的棉花莖尖置于共培養培養基上進行共培養；b.共培養后，將棉花莖尖轉入篩選培養基上培養；所述共培養培養基與篩選培養基中均含有濃度為0.3mg/L的KT和濃度為0.2mg/L的IAA。利用本發明專利技術方法進行無菌苗培養時間2-3天，共培養2天，篩選培養15-20天，生根培養20天，轉化周期不超過2個月，且經篩選后陽性轉化率能達到8％。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及棉花轉基因
，具體地說，涉及。
技術介紹
利用基因工程技術對棉花進行遺傳改良已取得重要進展。1987年Umbeck等首次報道通過農桿菌介導法將抗卡那霉素基因轉入棉花(Umbeck P.Genetically transformedcotton (Gosspium hirsutum L.) Plants.Bio/Teehnology, 1987, 5:263 ~266)。傳統的遺傳轉化方法轉化周期長、植株再生的基因型依賴性強、再生苗畸形率高、移栽成活率低，成為限制棉花轉基因育種研究的瓶頸。棉花莖尖具有直接分化再生的特點，一經轉化就可以在適當培養條件下誘導葉、根的形成而獲得轉基因植株。農桿菌介導的莖尖轉化方法不僅能夠解決基因型依賴性問題，還可縮短轉化周期和提高移栽成活率。Renfroe等利用棉花莖尖分生組織獲得再生植株以來，國內外很多學者也相繼利用莖尖分生組織獲得了棉花再生植株(RenfroeMH&Smith RH.1solation and culture of cotton protoplasts.Proc.Beltwide CottonProd.Conf., Natl.Cotton Council, Memphis, 1986, TN: 79 - 80)呂素蓮等利用棉花莖尖遺傳轉化方法將膽堿脫氫酶基因betA和突變的乙酞乳酸合成酶基因als成功轉入到3個棉花優良品種中，并獲得了抗除草劑氯磺隆和耐鹽性提高的轉基因植株及后代(呂 素蓮等.農桿菌介導的棉花莖尖遺傳轉化及轉betA植株的產生.高技術通訊，2004，11:20-25.)。但該技術方案主要是體外莖尖轉化法，沒有經過棉花細胞和組織培養過程，嵌合體幾率增加，不能穩定遺傳，后代不符合孟德爾遺傳規律。然而，許多經過了細胞和組織培養的棉花轉基因方法(如通過下胚軸轉化的方法)，由于下胚軸要經過愈傷組織的誘導及分化，轉化周期較長，一般6-9個月(劉明月，農桿菌介導棉花遺傳轉化體系優化，2011，第9頁)，且受轉化受體基因型的限制。還有一些莖尖為受體的基因槍轉化方法，但較農桿菌轉化方法而言，費用高，且有瞬時表達和嵌合體現象發生。有其他農桿菌介導的莖尖轉化方法表明，從共培養到獲得抗性株需3-4個月，周期較長(徐大偉等，2011年，中國農學通報)。
技術實現思路
為了解決現有技術中存在的問題，本專利技術的目的是提供一種縮短棉花轉化周期，提高棉花轉基因效率的方法。為了實現本專利技術目的，本專利技術首先提供，所述方法含有以下步驟:a.采用農桿菌介導法將含有目的基因的植物表達載體侵染棉花無菌苗莖尖，將侵染后的棉花莖尖置于共培養培養基上進行共培養；b.共培養后，將棉花莖尖轉入篩選培養基上培養；所述共培養培養基與篩選培養基中均含有濃度為0.3mg/L的激動素(KT)和濃度為0.2mg/L的吲哚-3-乙酸(IAA)。進一步地，侵染后的棉花莖尖置于共培養培養基上在21°C下暗培養48小時。進一步地，共培養后將棉花莖尖轉入篩選培養基上培養12-15d后，將生根和葉片正常的植株轉入生根培養基。進一步地，所述棉花無菌苗莖尖的培養方法為:將棉籽剝殼后露出棉仁，在無菌環境中用75%的酒精消毒Imin, 0.1%升萊消毒12min,再用無菌水清洗3_4次后,加入無菌水置于IOOrpm搖床中28°C培養至吸脹露白，置于種苗培養基上，28°C下暗培養2_3d后，將棉花無菌苗去掉子葉及葉原基，露出生長點并用解剖刀劃傷生長點，留取子葉下部約0.5~1.0cm部分成為棉花無菌苗莖尖。本專利技術還提供了一種提高棉花轉基因效率的共培養培養基，所述共培養培養基含有 0.3mg/L KT 和 0.2mg/L IAA。進一步地，所述共培養培養基含有MSB5、200 μ M乙酰丁香酮、30g/L葡萄糖和2.4g/L植物凝膠。MSB5是指MS無機鹽和B5有機物。本專利技術還提供了一種提高棉花轉基因效率的篩選培養基，所述篩選培養基含有0.3mg/L KT 和 0.2mg/L IAA。 進一步地，所述篩選培養基含有MSB5、200mg/L頭孢霉素(cef)、80mg/L卡那霉素(kan)、15g/L葡萄糖、15g/L蔗糖、2.4g/L植物凝膠。本專利技術還提供了前述共培養培養基和篩選培養基在提高棉花轉基因效率中的應用。本專利技術的有益效果在于:本專利技術通過設置不同的激素(組合)，優化了農桿菌介導的莖尖轉化技術體系，使轉化周期縮短，轉化率提高。利用本專利技術方法進行無菌苗培養時間2-3天，共培養2天，篩選培養15-20天，生根培養20天，轉化周期不超過2個月，且經篩選后陽性轉化率能達到8 %。目前能夠獲得再生植株的基因型多數為生產上淘汰的老品種，直接利用的價值不大，獲得的轉基因材料要通過雜交和多代回交，才能夠在生產上利用，大大降低了轉基因育種的利用價值。本專利技術采用的冀棉14農藝性狀較傳統的易轉化的老品種好。本專利技術中獲得的轉基因植株易生根，且易直接移栽，成活率達99%以上。移栽時土也不需要滅菌，較轉基因苗的嫁接及直接移栽滅菌土省力又省時。本申請選用生長2-3天的無菌苗莖尖為外植體，保證外植體的較強分裂和轉化能力。外植體的侵染時間也影響轉化率，侵染時間過長易引起后續實驗中的污染，侵染時間過短又造成轉化率低，因此本案中侵染15-20min，能保證較高的轉化率。【附圖說明】圖1為本專利技術實施例中莖尖轉化過程圖；其中，a.無菌苗；b.去掉子葉的莖尖；c.莖尖生長點；d.共培養；e.篩選初期；f.篩選后期；g.生根后煉苗；h.煉苗后移栽所述方法。圖2為本專利技術實施例中再生植株DNA的PCR擴增電泳檢測圖。【具體實施方式】以下實施例用于說明本專利技術，但不用來限制本專利技術的范圍。實施例1提高棉花轉基因效率I材料和方法1.1試驗材料本試驗供試材料為陸地棉(G.hirsutum L.)品種:冀棉14。轉化菌株:根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens) LBA4404。轉化基因GbAPX來自本實驗室構建的受黃萎病菌(Verticillium dahliae)脅迫的海島棉品種Pima90-53根組織轉錄組文庫。1.2主要試劑與藥品乙酰丁香酮、植物凝膠(phytagel)、植物生長調節劑(IAA和KT)、卡那霉素及頭孢霉素OPCR引物主要由生工生物工程有限公司合成。1.3試驗方法 1.3.1培養基制備根據表1制備所需培養基。表1試驗所用的培養基本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種提高棉花轉基因效率的方法，其特征在于，所述方法含有以下步驟：a.采用農桿菌介導法將含有目的基因的植物表達載體侵染棉花無菌苗莖尖，將侵染后的棉花莖尖置于共培養培養基上進行共培養；b.共培養后，將棉花莖尖轉入篩選培養基上培養；所述共培養培養基與篩選培養基中均含有濃度為0.3mg/L的激動素和濃度為0.2mg/L的吲哚?3?乙酸。

【技術特征摘要】
1.一種提高棉花轉基因效率的方法，其特征在于，所述方法含有以下步驟: a.采用農桿菌介導法將含有目的基因的植物表達載體侵染棉花無菌苗莖尖，將侵染后的棉花莖尖置于共培養培養基上進行共培養； b.共培養后，將棉花莖尖轉入篩選培養基上培養； 所述共培養培養基與篩選培養基中均含有濃度為0.3mg/L的激動素和濃度為0.2mg/L的吲哚-3-乙酸。2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，侵染后的棉花莖尖置于共培養培養基上在21°C下暗培養48小時。3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，共培養后將棉花莖尖轉入篩選培養基上培養12-15d后，將生根和葉片正常的植株轉入生根培養基。4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述棉花無菌苗莖尖的培養方法為:將棉籽剝殼后露出棉仁，在無菌環境中用75%的酒精消毒lmin，0.1%升汞消毒12min，再用無菌水清洗3-4次后，加入無菌水置于IOOrpm搖床中28°C培養至吸脹露白，置于種苗培養基上，...

【專利技術屬性】
技術研發人員：吳金華，王省芬，張桂寅，吳立強，李志坤，張艷，王國寧，柯會鋒，馬峙英，
申請(專利權)人：河北農業大學，
類型：發明
國別省市：河北;13