本發明專利技術中提供用于在宿主細胞中異源生產乙酰-CoA衍生的類異戊二烯的組合物和方法。在一些實施方案中，宿主細胞經遺傳修飾以包含編碼乙醛脫氫酶，酰化(ADA，E.C.1.2.1.10)的異源核苷酸序列，和包含利用NADP的HMG-CoA還原酶的MEV途徑。在一些實施方案中，宿主細胞經遺傳修飾以包含編碼ADA的異源核苷酸序列和包含乙酰乙酰-CoA合酶的MEV途徑。在一些實施方案中，經遺傳修飾的宿主細胞還包含一種或多種編碼磷酸轉酮酶和磷酸轉乙酰酶的異源核苷酸序列。在一些實施方案中，經遺傳修飾的宿主細胞還包含天然PDH旁路的功能性破壞。本文中所描述的組合物和方法為乙酰-CoA衍生的類異戊二烯的異源生產提供節能且氧化還原平衡的路徑。
【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】【專利摘要】本專利技術中提供用于在宿主細胞中異源生產乙酰-CoA衍生的類異戊二烯的組合物和方法。在一些實施方案中，宿主細胞經遺傳修飾以包含編碼乙醛脫氫酶，酰化(ADA，E.C.1.2.1.10)的異源核苷酸序列，和包含利用NADP的HMG-CoA還原酶的MEV途徑。在一些實施方案中，宿主細胞經遺傳修飾以包含編碼ADA的異源核苷酸序列和包含乙酰乙酰-CoA合酶的MEV途徑。在一些實施方案中，經遺傳修飾的宿主細胞還包含一種或多種編碼磷酸轉酮酶和磷酸轉乙酰酶的異源核苷酸序列。在一些實施方案中，經遺傳修飾的宿主細胞還包含天然PDH旁路的功能性破壞。本文中所描述的組合物和方法為乙酰-CoA衍生的類異戊二烯的異源生產提供節能且氧化還原平衡的路徑。【專利說明】乙酰輔酶A衍生的類異戊二烯的生產本申請要求2011年11月9日提交的美國臨時申請N0.61/557,893的優先權，據此通過提述完整并入其內容。1.專利
本公開文本涉及用于在工程化宿主細胞中生產乙酰-CoA衍生的類異戊二烯的組合物和方法。2.專利技術背景乙酰輔酶A(乙酰-CoA)是包括聚酮化合物，脂肪酸，類異戊二烯，酚類(pheno lies),生物堿，維生素和氨基酸在內的必需生物學化合物的合成中的關鍵中間體。在自乙酰-CoA衍生的代謝物中有初級和次級代謝物，包括有工業效用的化合物。例如，類異戊二烯用于醫藥產品及用作生物燃料，食品添加劑和其它專業化學藥品。類異戊二烯產品通常由重復的五碳異戊烯二磷酸(IPP)單元構成，盡管不規則的類異戊二烯和多萜也有報道。在自然界中，類異戊二烯通過它們的前體IPP和它的異構體二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)的連續縮合來合成。已知這些前體的兩條途徑。除一些例外以外，原核生物通常采用脫氧木酮糖-5-磷酸(DXP)途徑將丙酮酸和甘油醛3-磷酸(G3P)轉化成IPP和DMAPP。除植物以外，真核生物一般利用甲羥戊酸依賴性(MEV)途徑將乙酰-CoA轉化成ΙΡΡ,ΙΡΡ隨后異構化成DMAPP。單細胞真菌釀 酒酵母及其近緣生物利用兩種內源途徑生成乙酰-CoA。一條途徑發生在線粒體基質中，其中PDH復合物催化經糖酵解自葡萄糖生成的丙酮酸氧化脫羧成乙酰CoA。PDH復合物由60條多肽鏈組成,24條硫辛酰胺還原酶-轉乙酰酶(Iipoamidereductase-transacetylase)鏈，12 條二氫硫辛酸脫氫酶(dihydrolipoyl dehydrogenase)鏈,和24條丙酮酸脫羧酶(pyruvate decarboxylase)鏈。這種大型復合物將丙酮酸轉化成乙酰-CoA，生成NADH作為副產物。所得乙酰-CoA然后可以經檸檬酸循環完全氧化成CO2和&0以產生能量，或者用于在線粒體中實施的生物合成反應。在線粒體中生成的乙酰-CoA無法穿越線粒體膜進入胞質溶膠。因此，為了生成重要的初級和次級代謝物的生物合成需要的胞質溶膠乙酰-CoA，釀酒酵母利用位于胞質溶膠中稱作“PDH旁路”的一種獨立機制。這種多步驟途徑催化:(1)由丙酮酸脫羧酶(PDC，EC4.1.1.1)將丙酮酸脫羧成乙醛；(2)由乙醛脫氫酶(ACDH，ECl.2.1.5和ECl.2.1.4)將乙醛轉化成乙酸，這將一個NADP+還原成一個NADPH ;和(3)由乙酰-CoA合成酶(ACS，EC6.2.1.1)自乙酸和CoA合成乙酰-CoA，這將I個ATP水解成I個AMP，即將2個ATP水解成2個ADP的能量當量。由于自然界對于很多乙酰-CoA衍生的生物分子的提取僅提供低產率來源，因此利用經遺傳修飾的微生物進行的發酵生產已經因它們的產量而成為有前景的替代方式。然而，利用天然乙酰-CoA途徑生產乙酰-CoA中間體具有某些限制。例如，如圖1所示，經天然MEV途徑生產類異戊二烯對于生成的每個甲羥戊酸分子需要3個乙酰-CoA分子和氧化兩個NADPH。雖然PDH旁路每產生一個乙酰-CoA就生成一個NADPH，但是在該過程中消耗兩個ATP當量。如此，盡管NADPH的產生對于天然MEV途徑的輔因子要求是有益的，但是每生成一個甲羥戊酸消耗6個ATP當量導致低能效反應，因為必須將更多的碳源引向ATP合成，例如經TCA循環和氧化磷酸化，即以產物產率為代價。因此，設計高效生成乙酰-CoA衍生的化合物的生產宿主的挑戰之一是優化乙酰-CoA生成，使得ATP需求最小化，同時還滿足生物合成途徑的要求和輔因子。本文中提供的組合物和方法解決了這種需要并提供相關的優點。3.專利技術概述本文中提供的組合物和方法提供乙酰-CoA衍生的類異戊二烯的高能效且輔因子平衡的生產。通過利用異源酰化乙醛脫氫酶(也稱作“乙酰醛脫氫酶，乙酰化”，“乙酰醛脫氫酶，酰化”，或“ADA” (EC1.2.1.10))作為對于乙酰-Cok的胞質溶膠生成而言PDH旁路的替代，每生成一分子乙酰-Cok節省兩個ATP當量。ADA將乙醛直接轉化成乙酰-Coh,不消耗ATP，并在該過程中將一個NAD+還原成一個NADH。雖然可利用用ADA替換PDH旁路獲得的節省的ATP來獲取更高的產物產率，但是也存在與組合使用ADA與天然甲羥戊酸途徑有關的缺點。首先，天然PDH旁路的滅活去除了一種NADPH來源，而由ADA催化的反應產生NADH。因此，用ADA替換PDH旁路在沒有進一步途徑修飾的情況下會在消耗NADPH的類異戊二烯合成中引入氧化還原失衡。第二，ADA催化下述可逆反應:乙醛 + NAD+ + 輔酶A O 乙酰-CoA + NADH + ?\形成乙酰-CoA的天然PDH旁路反應是熱力學上有利的，因為該反應與ATP水解成AMP偶聯。相反，ADA反應不與ATP偶聯，而且比形成乙酰-Cok的天然PDH旁路反應更加接近平衡得多。因而，由ADA催化的反應具有更低的熱力學驅動力將乙醛轉化成乙酰-CoA，而且在沒有進一步途徑修飾的情況下ADA的理論能量增益可能無法實現。本文中描述的組合物和方法解決了這些缺點。在一些實施方案中，為了解決用ADA替換TOH旁路引入的氧化還原失衡，經遺傳修飾的宿主細胞還在類異戊二烯途徑中利用利用NADH的酶來消耗ADA產生的NADH。因此，可直接利用由ADA介導的乙醛轉化成乙酰-CoA所生成的NADH集合進行類異戊二烯合成。在一些實施方案中，利用NADH的酶是對于類異戊二烯途徑而言非天然的酶。例如，利用NADH的酶可替換對于類異戊二烯途徑而言天然的利用NADPH的酶。在具體的實施方案中，利用NADH的酶是利用NADH將HMG-CoA轉化成甲羥戊酸的3-羥基-3-甲基戊二酰-CoA還原酶(HMG-CoA還原酶)。在一些實施方案中，為了解決ADA反應更低的熱力學驅動力，經遺傳修飾的宿主細胞還在緊鄰乙酰-CoA的下游利用熱力學上有利的反應作為甲羥戊酸途徑的第一步，以拉動ADA反應。在一些實施方案中，由乙酰乙酰-Cok合酶(AACS ;也稱作乙酰-CoA:丙二酰-CoA酰基轉移酶)催化自乙酰-CoA形成乙酰乙酰-CoA。由于乙酰-CoA羧化酶生成丙二酰-CoA導致I個ATP的水解，因此由AACS催化的反應比由天然甲羥戊酸途徑的乙酰-CoA硫解酶催化的反應在熱力學上更加有利(圖5)。因此，AACS對乙酰-CoA提供更強的拉動來驅動ADA本文檔來自技高網...
【技術保護點】
能夠生成類異戊二烯的經遺傳修飾的宿主細胞，該細胞包含：(a)編碼甲羥戊酸(MEV)途徑中一種或多種用于生成異戊烯焦磷酸的酶的一種或多種異源核酸；和(b)編碼酰化乙酰醛(acetylaldehyde)脫氫酶(ADA)的異源核酸。
【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...
【專利技術屬性】
技術研發人員：T·S·加德納，K·M·霍金斯，A·L·梅多斯，A·E·聰，Y·策加耶，
申請(專利權)人：阿邁瑞斯公司，
類型：發明
國別省市：美國;US
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