整合編碼催化丙酮酸至乙酰乳酸的轉(zhuǎn)化的多肽的多核苷酸制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及具有至少一種整合多核苷酸的重組宿主細(xì)胞，所述多核苷酸編碼催化利用丙酮酸的生物合成途徑中的步驟（例如丙酮酸至乙酰乳酸的轉(zhuǎn)化）的多肽。本發(fā)明專利技術(shù)也涉及使用此類宿主細(xì)胞提高異丁醇、2，3-丁二醇、2-丁醇或2-丁酮的生物合成產(chǎn)量的方法。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
【國(guó)外來(lái)華專利技術(shù)】
本專利技術(shù)涉及工業(yè)微生物和丁醇及其異構(gòu)體的發(fā)酵生產(chǎn)領(lǐng)域。更具體地講，本專利技術(shù)涉及具有一種或多種整合多核苷酸的重組宿主細(xì)胞，所述多核苷酸編碼催化利用丙酮酸的生物合成途徑中的步驟(例如丙酮酸至乙酰乳酸的轉(zhuǎn)化)的多肽。
技術(shù)介紹
丁醇是重要的工業(yè)化學(xué)品，其用作燃料添加劑、塑料工業(yè)中的化學(xué)原料以及食品和香料工業(yè)中的食品級(jí)提取劑。每年由石油化學(xué)方法生產(chǎn)了 100至120億磅的丁醇，并且對(duì)這種通用化學(xué)品的需求還很可能會(huì)增加。2-丁酮，也被稱為甲基乙基酮(MEK)，是被廣泛使用的溶劑，并且是繼丙酮之后最重要的商品化生產(chǎn)的酮。它被用作用于漆料、樹脂和粘合劑的溶劑，以及選擇性提取劑、氧化反應(yīng)的活化劑，并且它能夠通過(guò)在催化劑的存在下與氫反應(yīng)而以化學(xué)方法被轉(zhuǎn)化為2- 丁醇(Nystrom等人，J.Am.Chem.Soc.,69:1198,1947)。2，3-丁二醇可被 用于丁烯和丁二烯(二者是重要的化工原料，目前由裂化石油獲得)的化學(xué)合成中，并且2，3- 丁二醇的酯可被用作增塑劑(Voloch等人,“FermentationDerived2, 3-Butanediol,，，！Comprehensive Biotechnology, Pergamon Press Ltd.,England，第 2 卷，第 3 節(jié)，第 933-947 頁(yè)，1986)。可工程化微生物以表達(dá)用于生產(chǎn)例如2，3-丁二醇、2-丁酮、2-丁醇和異丁醇的產(chǎn)物的生物合成途徑。美國(guó)專利7，851，188公開了用于生產(chǎn)異丁醇的工程化重組微生物。美國(guó)專利申請(qǐng)公布20070259410和20070292927公開了用于生產(chǎn)2- 丁酮或2- 丁醇的工程化重組微生物。已知多個(gè)用于異丁醇和2-丁醇的生物合成的途徑，它們?nèi)繌募?xì)胞的丙酮酸開始。丁二醇是2-丁醇途徑中的中間體，所述途徑在美國(guó)專利申請(qǐng)公布20070292927中公開。已經(jīng)改變了酵母中的丙酮酸代謝以生產(chǎn)乳酸和甘油。美國(guó)專利申請(qǐng)公布20070031950公開了帶有一種或多種丙酮酸脫羧酶或丙酮酸脫氫酶基因的破壞并且表達(dá)D-乳酸脫氫酶基因的酵母菌株，其被用于生產(chǎn)D-乳酸。Ishida等人(Biosc1.Biotech,and Biochem.，70:1148-1153，2006)描述了具有破壞的丙酮酸脫羧酶基因并表達(dá)乳酸脫氧酶的啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)。美國(guó)專利申請(qǐng)公布2005/0059136公開了沒(méi)有丙酮酸脫水酶活性的葡萄糖耐受的不依賴C2碳源(GCSI)的酵母菌株，其可以具有外源乳酸脫氫酶基因。Nevoigt等人(Yeast，12:1331-1337，1996)描述了在啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)中降低的丙酮酸脫羧酶和提高的NAD-依賴的甘油_3_磷酸脫氫酶對(duì)甘油產(chǎn)量的影響。工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)醇或其它化合物需要酵母細(xì)胞穩(wěn)定生產(chǎn)丙酮酸生物合成途徑的多核苷酸。此外還需要在重組宿主細(xì)胞如酵母中生產(chǎn)異丁醇、2，3- 丁二醇、2- 丁醇或2- 丁酮的改善方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本文提供了具有一種或多種整合多核苷酸的重組宿主細(xì)胞，所述多核苷酸編碼催化利用丙酮酸的生物合成途徑中的步驟(例如丙酮酸至乙酰乳酸的轉(zhuǎn)化)的多肽。與不具有編碼催化生物合成途徑步驟(例如丙酮酸至乙酰乳酸的轉(zhuǎn)化)的多肽的整合多核苷酸的宿主細(xì)胞相比，此類宿主細(xì)胞提供穩(wěn)定和/或增加生物合成途徑產(chǎn)物形成的方法，所述產(chǎn)物例如異丁醇、2，3- 丁二醇、2- 丁醇或2- 丁酮。本專利技術(shù)的一個(gè)方面涉及包含編碼多肽的多核苷酸的重組宿主細(xì)胞，所述多肽催化丙酮酸至乙酰乳酸的轉(zhuǎn)化，所述多核苷酸被整合到宿主細(xì)胞的染色體中。在另一方面，所述宿主細(xì)胞包含利用丙酮酸的生物合成途徑和編碼催化丙酮酸至乙酰乳酸的轉(zhuǎn)化的多肽的多核苷酸，所述多核苷酸被整合到宿主細(xì)胞的染色體中。在另一方面，所述多核苷酸是宿主細(xì)胞異源性的。本專利技術(shù)的一個(gè)方面涉及重組宿主細(xì)胞，其包含異丁醇生物合成途徑，其中所述途徑包括由多肽催化的丙酮酸至乙酰乳酸的底物至產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化，所述多肽由整合到染色體中的異源性多核苷酸編碼，并且其中所述途徑包括由多肽催化的乙酰乳酸至2，3- 二羥基異戊酸的底物至產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化，所述多肽由質(zhì)粒上的多核苷酸編碼。在多個(gè)實(shí)施例中，與編碼催化丙酮酸至乙酰乳酸的轉(zhuǎn)化的多肽的多核苷酸沒(méi)有被整合到染色體中的重組宿主細(xì)胞相t匕，所述異丁醇生產(chǎn)的滴度是提高的。本專利技術(shù)的一個(gè)方面涉及重組宿主細(xì)胞，其包含2，3- 丁二醇、2- 丁醇或2- 丁酮生物合成途徑，其中所述途徑包括由多肽催化的丙酮酸至乙酰乳酸的底物至產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化，所述多肽由整合到染色體中的異源性多核苷酸編碼，并且其中所述途徑包括至少一種由多肽催化的底物至產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化，所述多肽由質(zhì)粒上的多核苷酸編碼。在多個(gè)實(shí)施例中，與編碼催化丙酮酸至乙酰乳酸的轉(zhuǎn)化的多肽的多核苷酸沒(méi)有被整合到染色體中的重組宿主細(xì)胞相比，所述2，3- 丁二醇、2- 丁醇或2- 丁酮生產(chǎn)的滴度是提高的。在另一方面，本專利技術(shù)涉及重組宿主細(xì)胞，其包含編碼第一多肽的第一異源性多核苷酸，所述第一多肽催化利用丙酮酸的生物合成途徑的轉(zhuǎn)化步驟；編碼第二多肽的第二異源性多核苷酸，所述第二多肽催化利用丙酮酸的生物合成途徑的轉(zhuǎn)化步驟；和編碼第三多肽的第三異源性多核苷酸，所述第三多肽催化利用丙酮酸的生物合成途徑的轉(zhuǎn)化步驟；其中所述第一和第二異源性多核苷酸被整合到宿主細(xì)胞的染色體中；其中所述第三異源性多核苷酸沒(méi)有被整合到宿主細(xì)胞的染色體中；并且其中所述第一、第二、和第三多肽催化利用丙酮酸的生物合成途徑的不同步驟。 在另一方面，本專利技術(shù)涉及重組宿主細(xì)胞，其包含(a)編碼第一多肽的第一異源性多核苷酸，所述第一多肽催化丙酮酸至乙酰乳酸的底物至產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化；(b)編碼第二多肽的第二異源性多核苷酸，所述第二多肽催化α-酮異戊酸至異丁醛的底物至產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化；和(c)編碼第三多肽的第三異源性多核苷酸，所述第三多肽催化不是(a)或(b)的轉(zhuǎn)化步驟的異丁醇生物合成途徑轉(zhuǎn)化步驟；其中所述第一和第二異源性多核苷酸被整合到染色體中；其中所述第三異源性多核苷酸沒(méi)有被整合到染色體中；并且其中所述宿主細(xì)胞產(chǎn)生異丁醇。在另一方面，本專利技術(shù)涉及重組宿主細(xì)胞，其包含(a)編碼第一多肽的第一異源性多核苷酸，所述第一多肽催化α -酮異戊酸至異丁醛的底物至產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化；和6)編碼第二多肽的第二異源性多核苷酸，所述第二多肽催化不是(a)的轉(zhuǎn)化步驟的異丁醇生物合成途徑轉(zhuǎn)化步驟；其中所述第一異源性多核苷酸被整合到染色體中；其中所述第二異源性多核苷酸沒(méi)有被整合到染色體中；并且其中所述宿主細(xì)胞產(chǎn)生異丁醇。在本專利技術(shù)的多個(gè)方面，所述宿主細(xì)胞是細(xì)菌、藍(lán)細(xì)菌、絲狀真菌或酵母。在另一方面，宿主細(xì)胞是下列屬的成員:梭菌屬(Clostridium)、發(fā)酵單胞菌屬(Zymomonas)、埃希氏菌屬(Escherichia)、沙門氏菌屬(Salmonella)、紅球菌屬(Rhodococcus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、芽抱桿菌屬(Bacillus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、腸球菌屬(Enterococcus)、產(chǎn)喊桿菌屬(Alcaligenes)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、伊薩酵母屬(Issatchenkia本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】

【技術(shù)特征摘要】
【國(guó)外來(lái)華專利技術(shù)】2010.09.07 US 61/380,563;2011.03.23 US 61/466,5571.重組宿主細(xì)胞，包含異丁醇生物合成途徑，其中所述途徑包括由整合到染色體中的異源性多核苷酸編碼的多肽催化的丙酮酸至乙酰乳酸的底物至產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化，并且其中所述途徑包括由質(zhì)粒上的多核苷酸編碼的多肽催化的乙酰乳酸至2，3- 二羥基異戊酸的底物至產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化，并且其中與編碼催化丙酮酸至乙酰乳酸的轉(zhuǎn)化的多肽的多核苷酸沒(méi)有被整合到染色體中的重組宿主細(xì)胞相比，所述異丁醇生產(chǎn)的滴度是提高的。2.重組宿主細(xì)胞，包含2，3-丁二醇、2- 丁醇或2- 丁酮生物合成途徑，其中所述途徑包括由整合到染色體中的異源性多核苷酸編碼的多肽催化的丙酮酸至乙酰乳酸的底物至產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化，并且其中所述途徑包括至少一種由質(zhì)粒上的多核苷酸編碼的多肽催化的底物至產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞選自:細(xì)菌、藍(lán)細(xì)菌、絲狀真菌和酵母。4.根據(jù)權(quán)利要求1至2中任一項(xiàng)所述的重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是選自下列屬的成員:梭菌屬(Clostridium)、發(fā)酵單胞菌屬(Zymomonas)、埃希氏菌屬(Escherichia)、沙門氏菌屬(Salmonella)、紅球菌屬(Rhodococcus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、芽抱桿菌屬(Bacillus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、腸球菌屬(Enterococcus )、產(chǎn)喊桿菌屬(Alcali genes)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、類芽抱桿菌屬(Paenibacillus)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、短桿菌屬(Brevibacterium)、畢赤酵母屬(Pichia)、假絲酵母屬(Candida)、漢遜酵母屬(Hansenula)、伊薩酵母屬(Issatchenkia)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)和糖酵母屬(Saccharomyces)。5.根據(jù)權(quán)利要求1至2中任一項(xiàng)所述的重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌(Escherichia coli)。6.根據(jù)權(quán)利要求1至2中任一項(xiàng)所述的重組宿主細(xì)胞，其中所述多肽是在所述宿主細(xì)胞胞質(zhì)溶膠中表達(dá)的。7.根據(jù)權(quán)利要求1至2中任一項(xiàng)所述的重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)。8.根據(jù)權(quán)利要求1至2中任一項(xiàng)所述的重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)。9.根據(jù)權(quán)利要求1或3至8中任一項(xiàng)所述的重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞還包含編碼多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列底物至產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化:2，3- 二羥基異戊酸至α -酮異戊酸；α -酮異戊酸至異丁醛；以及異丁醛至異丁醇。10.根據(jù)權(quán)利要求1或2至8中任一項(xiàng)所述的重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞還包含編碼多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列底物至產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化:2，3- 二羥基異戊酸至α -酮異戊酸；α -酮異戊酸至異丁酰-CoA ;異丁酰-CoA至異丁醛；以及異丁醛至異丁醇。11.根據(jù)權(quán)利要求1或2至8中任一項(xiàng)所述的重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞還包含編碼多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列底物至產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化:2，3- 二羥基異戊酸至α -酮異戊酸；α-酮異戊酸至纈氨酸；纈氨酸至異丁胺；異丁胺至異丁醛；以及異丁醛至異丁醇。12.根據(jù)權(quán)利要求2至8中任一項(xiàng)所述的重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞還包含編碼多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列底物至產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化:乙酰乳酸至乙偶姻；乙偶姻至·2，3- 丁二醇；以及2，3- 丁二醇至2- 丁酮。13.根據(jù)權(quán)利要求2至8中任一項(xiàng)所述的重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞還包含編碼多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列底物至產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化:乙酰乳酸至乙偶姻；乙偶姻至·2，3- 丁二醇；2，3- 丁二醇至2- 丁酮；以及2- 丁酮至2- 丁醇。14.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的重組宿主細(xì)胞，其中所述催化丙酮酸至乙酰乳酸的底物至產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化的多肽是乙酰乳酸合酶。15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的重組宿主，其中所述乙酰乳酸合酶與選自SEQID N0:2、4、6、8、10、12、14、16或18的氨基酸序列具有至少約80%的同一性。16.根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)所述的重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞中丙酮酸脫羧酶的表達(dá)是降低的或基本上消除的。17.根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)所述的重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞包含內(nèi)源性多核苷酸中的缺失、突變、和/或替換，所述內(nèi)源性多核苷酸編碼具有丙酮酸脫羧酶活性的多肽。18.根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)所述的重組宿主細(xì)胞，其中所述多核苷酸被整合到內(nèi)源性多核苷酸中，所述多核苷酸編碼催化丙酮酸至乙酰乳酸的轉(zhuǎn)化的多肽，所述內(nèi)源性多核苷酸編碼具有丙酮酸脫羧酶活性的多肽。19.根據(jù)權(quán)利要求1至18中任一項(xiàng)所述的重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞中甘油-3-磷酸脫氫酶的表達(dá)是降低的或基本上消除的。20.根據(jù)權(quán)利要求1至19中任一項(xiàng)所述的重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞中Fra2的表達(dá)是降低的或基本上消除的。21.根據(jù)權(quán)利要求1至20中任一項(xiàng)所述的重組宿主細(xì)胞，其中所述多核苷酸被整合到染色體中roc1-TRXI基因間區(qū)域處。22.重組宿主細(xì)胞，包含:(a)編碼多肽的多核...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：LC安東尼，LA馬吉奧霍爾，BJ保羅，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：布特馬斯先進(jìn)生物燃料有限責(zé)任公司，
類型：
國(guó)別省市：