β-葡糖苷酶激活劑用于檢測和/或鑒定難辨梭菌的用途制造技術

本發明專利技術涉及包含至少一種β-葡糖苷酶底物和不同于所述底物的通式Ar-β-D-葡糖苷的化合物的反應培養基，其中Ar-表示芳香化合物。根據本發明專利技術，這樣的培養基可用于檢測和/或鑒定難辨梭菌(C.difficile)的方法中。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】β-葡糖苷酶激活劑用于檢測和/或鑒定難辨梭菌的用途本專利技術涉及檢測和/或鑒定難辨梭菌(Clostridiumdifficile)的方法。其還涉及對難辨梭菌具有特異性的包含β葡糖苷酶激活劑的反應培養基。難辨梭菌(C.difficile)是革蘭氏陽性芽孢桿菌，其是完全厭氧的且形成孢子。難辨梭菌是嚴重程度不定的腸疾病的病因：中度或爆發性腹瀉、假膜性結腸炎或中毒性巨結腸，這些病癥自身可以成為膿毒癥的原因。難辨梭菌通過經口攝入對胃酸耐受且在腸中萌發的孢子來傳染。結腸的共生菌落的失衡能使難辨梭菌增殖，這產生成為結腸炎病因的毒素。在許多情況下，共生菌落的失衡歸因于服用抗生素。難辨梭菌可以被認為是無害的環境微生物，其在某些條件下變成機會致病菌。難辨梭菌的無癥狀消化系統攜帶者在成年人群中估計為3%，但在抗生素治療或在高流行性單位停留之后達到個體的15%至25%。通常觀察到高攜帶水平，從住院患者的20%至40%高達至幼兒的50%至70%。能夠早期且迅速的診斷是預防嚴重并發癥和有效醫療護理的關鍵要素。診斷基于對毒素的尋找并基于培養。毒素直接從糞便的分離是難辨梭菌的產毒菌株存在的優異標記。參考方法在于通過細胞培養來尋找致細胞病變作用(在英語中，CTA表示細胞毒活性)。該方法非常靈敏，但未被標準化，并且需要專門的技術人員和幾天的響應時間。已經開發了ELISA型免疫酶試驗，其檢測單獨的毒素A或者毒素A和B。獲得結果的時間降低了。然而，推薦將用于檢測毒素的免疫學技術與細菌培養組合以分離難辨梭菌菌株。可在由本申請人銷售的難辨梭菌瓊脂上采用該培養，然后通過生物化學方法（例如20A試條(gallery)或快速ID32A試條）來鑒定難辨梭菌菌落。然而，通過試條鑒定必須使要鑒定的細菌的純培養物在合適的生長培養基上，以獲得足夠的生物質(3至4McFarland)，這在最好的情況下耗時48小時(從采樣開始24至72小時的分離培養(這僅給出了假定的檢測)，然后24至72小時的培養以產生足夠的生物質)。然后，對于ID32A試條，在孵育4小時后進行試條的讀數，對于20A試條，在孵育24至48小時之后進行試條的讀數。最終，可以使用分子生物技術進行診斷。然而，這些技術并非目前常用的。通過本申請人為了改善在細菌培養物中直接鑒定難辨梭菌而進行的工作，本申請人證明，β-葡糖苷酶酶底物的使用可以容易且快速地鑒定難辨梭菌。所述β-葡糖苷酶底物的使用在申請WO2009/092982中描述為減少獲得難辨梭菌鑒定結果所用的時間。早期且迅速地鑒定在樣品中可能存在的難辨梭菌仍是主要目的，并且本申請人已經通過更特別地尋求加快酶活性的顯示來繼續從事其工作。因此，本申請人已經出乎預料地證明，包含β-葡糖苷酶底物和通式Ar-β-D-吡喃葡糖苷的β-葡糖苷酶激活劑的反應培養基使難辨梭菌在樣品中被迅速鑒定，換言之，這樣的培養基使至少一些難辨梭菌菌株的酶活性被更早地檢測，在所述通式中，Ar-對應于芳環或多個毗連的芳環。Ar-β-D-葡糖苷化合物的使用使β-葡糖苷酶被激活并且能觀察到難辨梭菌菌落的明顯更強的著色。有利地，所述Ar-β-D-葡糖苷化合物具有遠優于其他β-D-葡糖苷衍生物（例如纖維二糖（4-O-β-D-吡喃葡萄糖基-D-葡萄糖）或甲基-β-D-葡萄糖）的難辨梭菌β-葡糖苷酶激活能力。已知的是，通式Ar-β-D-葡糖苷的化合物能用作β-葡糖苷酶底物，在所述通式中，Ar表示至少一種同素環的或雜環的芳環。該用途報道于申請WO2009/092982(如上)中。同樣，Hildebrand和Schroth報道了熊果苷或氫醌β-D-吡喃葡糖苷作為碳源以0.5%重量/體積(換言之，5g/l)的濃度與葡萄糖組合用于反應培養基中。由色譜方法測定的熊果苷在氫醌中的水解是丁香假單胞菌(Pseudomonassyringae)的β-葡糖苷酶活性的標記(Hildebrand和Schroth,AppliedMicrobiology,1964;12(6):487-491)。這阻礙了本領域技術人員將Ar-β-D-葡糖苷化合物作為β-葡糖苷酶激活劑用于反應培養基中以檢測或鑒定難辨梭菌，因為他們會發現其自身與旨在顯示靶微生物的酶活性的底物競爭。最后，現有技術報道了口服給予的熊果苷被排泄和代謝在尿中，并且由于其利尿和抗菌性質可以加以使用(Schindler等人,2002;J.Clin.Pharmacol.;42(8):920-927;Siegers等人,2003,Phytomedicine;10(Suppl4):58-60)。這樣的用途也阻礙了將熊果苷用于反應培養基中以檢測細菌。在詳細描述本專利技術之前，給出下列定義以更好地理解本專利技術。它們不以任何方式進行限制。反應培養基應理解為包含微生物的代謝表達和/或生長所必須的所有成分的培養基。所述反應培養基可以是固體的、半固體的或液體的。固體培養基應理解為凝膠化的培養基。瓊脂是微生物學中常見的用于培養微生物的凝膠劑，但可以使用明膠、瓊脂糖或者其他天然或人造的凝膠劑。許多制劑是可商購的，例如Columbia瓊脂、Trypcase-大豆瓊脂、MacConkey瓊脂、Sabouraud瓊脂，或更一般來說例如在HandbookofMicrobiologicalMedia(CRCPress)中描述的那些。本專利技術的反應培養基必須允許難辨梭菌生長。所述反應培養基可以包含一種或多種組合的成分，例如氨基酸、蛋白胨、碳水化合物、核苷酸、礦物質、維生素等。所述培養基還可以包含著色劑。作為指示，可以例舉依文思藍、中性紅、羊血、馬血、諸如氧化鈦的遮光劑、硝基苯胺、孔雀石綠、亮綠、一種或多種代謝指示劑、一種或多種代謝調節劑等作為著色劑。所述反應培養基可以為顯示培養基、或者培養顯示培養基。在第一種情況下，微生物的培養在接種之前進行，在第二種情況下，檢測和/或鑒定培養基還構成了培養培養基。本領域技術人員還可使用鴛鴦平板（bi-biote），其可以容易地比較兩種包含不同底物或不同選擇性混合物的培養基，并且在其上已沉積了相同的生物樣品。所述反應培養基可以包含難辨梭菌菌株的一種或多種生長激活劑。生長激活劑應理解為刺激微生物生長的一種化合物或一組化合物。特別地，可以例舉血液、血清和蛋黃。非限制性地提及，0.1%至10%的濃度特別適于本專利技術。所述反應培養基可以包含一種或多種還原劑。還原劑應理解為通過中和在培養基中存在的溶解的氧來促進厭氧細菌生長的一種化合物或一組化合物。特別地，可以例舉半胖氨酸、丙酮酸鹽、去氧酶(l’Oxyrase)、亞硫酸鈉、二硫酸鹽、組氨酸和硫化亞鐵。非限制性地提及，0.05g/l至50g/l、優選0.1g/l至2g/l的濃度特別適于本專利技術。所述反應培養基可以包含一種或多種難辨梭菌孢子萌發誘導劑。孢子萌發誘導劑應理解為促進難辨梭菌從孢子狀態到植物狀態的一種化合物或一組化合物。特別地，可以例舉牛磺膽酸鈉。非限制性地提及，0.1g/l至10g/l、優選1g/l至5g/l的濃度特別適于本專利技術。所述反應培養基可以包含一種或多種選擇性藥劑。選擇性藥劑應理解為能阻止或減緩除靶微生物之外的微生物生長的任何化合物。非限制性地提及，5mg/l至5g/l的濃度特別適于本專利技術。可以例舉抗生素和抗真菌劑作為選擇本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2010.09.01 FR 10569281.反應培養基，其包含至少一種β-葡糖苷酶底物和濃度低于5g/l的不同于所述底物的通式Ar-β-D-葡糖苷的β-葡糖苷酶激活劑，其中Ar-表示芳香化合物，所述β-葡糖苷酶激活劑選自氫醌-β-D-吡喃葡糖苷、4-甲基傘形酮-β-葡糖苷、4-氨基苯基-β-葡糖苷或2-(羥基甲基)苯基-β-D-葡糖苷。2.權利要求1的反應培養基，其中所述β-葡糖苷酶激活劑的濃度為0.3g/l至1.5g/l。3.權利要求1的反應培養基，其中所述β-葡糖苷酶激活劑為氫醌-β-D-吡喃葡糖苷。4.權利要求1的反應培養基，其中所述β-葡糖苷酶底物選自茜素-β-葡糖苷、品紅-β-葡糖苷(5-溴-6-氯-3-吲哚氧基-β-葡糖苷)、DHF-β-葡糖苷、3HF-β-葡糖苷和CHE-β-葡糖苷(3,4-環己烯并七葉亭-β-葡糖苷)以及ALDOLTMβ-葡糖苷。5.權利要求1的反應培養基，其中所述β-葡糖苷酶底物的濃度為25mg/l至1000mg/l。6.權利要求5的反應培養基，其中所述β-葡糖苷酶底物的濃度為50mg/l至400mg/l。7.權利要求1至6中任一...

【專利技術屬性】
技術研發人員：M·塞利耶，D·哈利米，S·奧倫加，
申請(專利權)人：生物梅里埃公司，
類型：
國別省市：