修飾的RNAi試劑制造技術

本發明專利技術的一個方面涉及能夠抑制一種靶基因的表達的雙鏈RNAi(dsRNA)雙鏈體試劑。該dsRNA雙鏈體在一條或兩條鏈中包括一個或多個在三個連續核苷酸上具有三個相同修飾的基序，特別是在該鏈的裂解位點處或附近。本發明專利技術的其他方面涉及包括這些適于治療用途的dsRNA試劑的藥物組合物以及通過給予這些dsRNA試劑來抑制一種靶基因的表達的方法，例如用于治療各種疾病病癥。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】【專利摘要】本專利技術的一個方面涉及能夠抑制一種靶基因的表達的雙鏈RNAi(dsRNA)雙鏈體試劑。該dsRNA雙鏈體在一條或兩條鏈中包括一個或多個在三個連續核苷酸上具有三個相同修飾的基序，特別是在該鏈的裂解位點處或附近。本專利技術的其他方面涉及包括這些適于治療用途的dsRNA試劑的藥物組合物以及通過給予這些dsRNA試劑來抑制一種靶基因的表達的方法，例如用于治療各種疾病病癥。【專利說明】修飾的RNAi試劑 相關申請 本申請要求于2011年11月18日提交的美國臨時申請號61/561，710的優先權， 將該申請的全部內容通過引用特此結合在此。 專利
本專利技術涉及具有有利抑制靶基因表達的特定基序的RNAi雙鏈體試劑以及適于治 療使用的RNAi組合物。額外地，本專利技術提供了通過給予這些RNAi雙鏈體試劑來抑制靶基 因的表達的方法，例如用于治療各種疾病。 背景 RNA干擾或"RNAi"是一個最初由費爾（Fire)和同事創造的術語，用來描述觀察 到雙鏈RNAi(dsRNA)可以阻斷基因表達（菲爾等人（1998)Nature(自然）391，806-811 ; Elbashir (艾巴施）等人（2001)Genes Dev.(基因與發育）15，188-200)。短 dsRNA 在許多 有機體（包括脊椎動物）中指導基因特異性的轉錄后沉默，并且已經為研究基因功能提供 了一個新的工具。RNAi由RNA誘導沉默復合體（RISC)介導，RISC是一種破壞與沉默觸發 物同源的信使RNA的序列特異性多組分核酸酶。已知RISC包含來自雙鏈RNA觸發物的短 RNA(大約22個核苷酸），但是這一活性的蛋白組分仍是未知的。 基于RNA干擾（RNAi)的藥物開發需要具有良好基因沉默特性的雙鏈RNA (dsRNA) 分子。RNAi中的最初步驟是RNA誘導沉默復合體（RISC)的活化，這需要降解dsRNA雙鏈體 的有義鏈。已知有義鏈作為被在雙鏈體區的中部的Argonaute2裂解的第一 RISC底物。有 義鏈的裂解的5'-端和3'-端片段從核酸內切酶Ag〇2移除后，RISC立刻被反義鏈活化 (Rand(蘭德）等人（2005) Cell (細胞）123,621)。 相信當有義鏈的裂解被抑制時，靶標mRNA的內切核苷酸裂解會受損 (Leuschner (洛伊什納）等人（2006)EMB0 Rep. (ΕΜΒ0 報告），7,314 ;蘭德等人（2005)細胞 123,621 ;Schwarz (施瓦茲）等人（2004) Curr. Biol.(當代生物學）14, 787)。洛伊什納等 人證明向有義鏈中的Ag〇2裂解位點中摻入2' -Ο-Me核糖抑制海拉細胞中的RNAi (洛伊什 納等人（2006) ΕΜΒ0報告，7, 314)。用硫代磷酸酯修飾觀察到類似效果，這顯示在哺乳動物 中有效的RNAi也需要有義鏈的裂解。 Morrissey (莫里西）等人使用了除其他位點和修飾之外還在Ago2裂解位點處包 含V -F修飾的殘基的siRNA雙鏈體，并且獲得了與未修飾的siRNA相比可相容的沉默 (莫里西等人（2005)H印at〇l 〇gy(肝病學）41，1349)。然而，莫里西的修飾不是基序特異性 的，例如只要嘧啶殘基存在，一個修飾便包括在有義鏈和反義鏈上的所有嘧啶上的2' -F 修飾，而沒有任何選擇性；并且因此基于這些教導，有義鏈的裂解位點處的特異性基序修飾 對基因沉默活性是否具有任何實質作用是不確定的。 Muhonen(穆漢恩）等人使用了在有義鏈或反義鏈上的Ago2裂解位點處包 含兩個2' -F修飾的殘基的siRNA雙鏈體并且發現這被容忍（穆漢恩等人（2007) Chemistry&Biodiversity (化學與生物多樣性）4,858-873)。然而，穆漢恩的修飾也是序列 特異性的，例如對于每一具體鏈而言，穆漢恩僅修飾所有的嘧啶或所有的嘌呤，而沒有任何 選擇性。 Choung(莊）等人使用了包含替代性修飾的siRNA雙鏈體，通過Y -OMe或 2' -F、2< -OMe和硫代磷酸酯修飾的不同組合以將血清中的siRNA穩定為Surl0058(莊等 人（2006) Biochemical and Biophysical Research Communications (生物化學和生物物 理研究通訊）342,919-927)。莊建議為了增加 siRNA的穩定性不應該用W -〇Me修飾反義 鏈的裂解位點處的殘基。 因此對用于改進siRNA基因治療的基因沉默療效的iRNA雙鏈體試劑存在持續的 需要。本專利技術即針對這一需要。 概述 本專利技術提供了針對任選地結合至至少一個配體的dsRNA試劑的有利抑制靶基因 表達的有效的核苷酸或化學基序，以及適于治療使用的RNAi組合物。 諸位專利技術人出人意料地發現：在由修飾的有義鏈和反義鏈組成的dsRNA試劑的裂 解位點處或附近引入一個或多個在三個連續的核苷酸上具有三個相同修飾的基序會增強 該dsRNA試劑的基因沉默活性。 在一個方面中，本專利技術涉及一種能夠抑制靶基因的表達的雙鏈RNAi (dsRNA)試 齊[J。該dsRNA試劑包括有義鏈和反義鏈，每條鏈具有14至30個核苷酸。該dsRNA雙鏈體 由式（III)表示： 有義鏈：5，np-Na- (XXX)「Nb-YYY-Nb- (ZZZ) rNa-n(13， 反義鏈：3，np'-Na'-(X，X，X，）k-N/ -Y，Y，Y，-Nb'-(Z，Z，Z，） l_Na，_nq ' 5， (III)， 在式（III)中，i、j、k、以及1各自獨立地是0或1 ;p和q各自獨立地是0-6 ;n表 示一個核苷酸；每個Na和獨立地表示一個包括0-25個被修飾或未被修飾或其組合的 核苷酸的寡核苷酸序列，每個序列包括至少兩個不同修飾的核苷酸；每個Nb和N/獨立地 表示一個包括0-10個被修飾或未被修飾或其組合的核苷酸的寡核苷酸序列；每個n p和η, 獨立地表示一個包括0-6個核苷酸的突出端核苷酸序列；并且XXX、ΥΥΥ、ΖΖΖ、Χ' X' X'、 Υ' 、以及Ζ' Ζ' Ζ'各自獨立地表示一個在三個連續核苷酸上具有三個相同修飾 的基序；其中Nb上的修飾不同于Υ上的修飾并且Nb'上的修飾不同于Υ'上的修飾。至少 一個Y核苷酸與其互補Y'核苷酸形成一個堿基對，并且其中Y核苷酸上的修飾不同于Y' 核苷酸上的修飾。 每個np和η,獨立地表示一個包括0-6個核苷酸的突出端核苷酸序列；每個η和 η'表不一個突出端核苷酸；并且ρ和q各自獨立地是0-6。 在另一個方面中，本專利技術涉及一種能夠抑制靶基因的表達的dsRNA試劑。該dsRNA 試劑包括有義鏈和反義鏈，每條鏈具有14至30個核苷酸。該有義鏈包含至少兩個在三個 連續核苷酸上具有三個相同修飾的基序，其中至少一個基序出現在該鏈內的裂解位點處或 附近并且至少一個基序出現在由至少一個核苷酸在裂解位點處將其與該基序分開的該鏈 的另一個部分處。該反義鏈包含至少一個在三個連續核苷酸上具有三個相同修飾的基序， 其中至少一個基序出現在該鏈內的裂解位點處或附近并且至少一個基序出現在由至少一 個核苷酸在裂解位點處或附近將其與該基序分開的該鏈的另一個部分處。出現在該本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種能夠抑制一種靶基因的表達的雙鏈RNAi試劑，包括有義鏈和反義鏈，每條鏈具有14到30個核苷酸，其中該雙鏈體由式(III)表示：有義鏈：5′np?Na?(XXX)i?Nb?YYY?Nb?(ZZZ)j?Na?nq3′反義鏈：3′np’?Na’?(X’X′X′)k?Nb’?Y′Y′Y′?Nb’?(Z′Z′Z′)l?Na’?nq’5′(III)其中：i、j、k以及l各自獨立地是0或1；p和q各自獨立地是0?6；每個Na和Na′獨立地表示一個包括0?25個被修飾或者未被修飾或其組合的核苷酸的寡核苷酸序列，每個序列包括至少兩個不同修飾的核苷酸，每個Nb和Nb′獨立地表示一個包括0?10個被修飾或者未被修飾或其組合的核苷酸的寡核苷酸序列；每個np、np’、nq以及nq’獨立地表示一個包括0?6個核苷酸的突出端核苷酸序列；并且XXX、YYY、ZZZ、X′X′X′、Y′Y′Y′以及Z′Z′Z′各自獨立地表示一個在三個連續核苷酸上具有三個相同修飾的基序；并且其中Nb上的該修飾不同于Y上的該修飾并且Nb′上的該修飾不同于Y′上的該修飾。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...

【專利技術屬性】
技術研發人員：K·G·拉杰夫，T·齊默爾曼，M·馬諾哈倫，M·梅爾，S·庫奇曼奇，K·查里斯，
申請(專利權)人：阿爾尼拉姆醫藥品有限公司，
類型：發明
國別省市：美國;US